血浆中乙基葡萄糖醛酸苷含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-143Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-645 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn ATLAS-LEXT NHD 结合 LCMSMS检测血浆中乙基葡萄糖醛酸苷含量 LCMSMS-645 摘要：本文建立了一种使用 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置及液质联用仪测定血浆中乙醇标志性代谢物- 乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的方法。实验结果表明：该方法重复性良好，不同浓度基质加标样品以ATLAS-LEXT NHD各自处理6个平行样，保留时间RSD 在0.11~0.16%之间，峰面积RSD在2.88~4.96%之间；加标回收率在78.1%~80.3%之间。该方法具有自动化程度高、通量高、回收率和重复性好的特点，利用了ATLAS-LEXT NHD 自定义编程功能进行蛋白沉淀，可减少人为操作带来的误差和化学试剂暴露风险，可用于血样中 EtG的测定，供公安司法相关检测人员参考。 关键词：乙基葡萄糖醛酸苷ATLAS-LEXT NHD)LCMS-8050 乙基葡萄糖醛酸苷 (Ethyl Glucuronide，EtG) 是乙醇在人体内代谢的标志性代谢物，是判定个体在12h内是否饮酒的重要证据。此外，血液和尿液中 EtG的测定，对判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。 EtG 的检测方法有 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS 等，LC-MS/MS检测 EtG 不需要衍生，相对更为便捷。 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置可以对唾液、尿液、血液等样品中的目标组分自动进行液-液萃取和蛋白沉淀等操作，自动化程度高，可节省大量时间，提高效率，降低人为失误，并减少使用大量有机溶剂对实验人员造成的身体危害。本文利用 ATLAS-LEXTNHD结合三重四极杆液质联用仪，建立了血浆中EtG的检测方法。 本实验使用 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置及岛津三重四极杆液质联用仪。具体配置为： 系统控制器： CBM-20A 脱气机： DGU-20A 输液泵： LC-20ADXR×2 自动进样器： SIL-20AC 柱温箱： CTO-20AC 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 质谱仪： LCMS-8050 前处理仪： ATLAS-LEXT NHD 图1 ATLAS-LEXTNHD系统(左)和LCMS-8050(右) 1.2分析条件 ATLAS-LEXT NHD蛋白定淀前处理条件 混合强度：9级离心速度：5750rpm混合时间：90 sec离心时间：180 sec样品用进样针清洗量：3000uL清洗溶液：0%甲醇 进样针排液高度：70 cm 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18， 150 mm×2.1 mml.D.， 3um P/N： 227-30008-07，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-0.01%甲酸水溶液，B相-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量： 1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，洗脱程序见表 表1 洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.2 Pumps Pump B Conc. 10 1.8 Pumps Pump B Conc. 90 2.8 Pumps Pump B Conc. 90 2.9 Pumps Pump B Conc. 5 6.0 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI 雾化气：氮气 3.0 L/min 干燥气：氮气10.0L/min 加热气：空气10.0L/min 接口温度：300℃ 加热模块温度：400℃ DL温度：250℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 221.10 75.10* 11.0 16.0 14.0 乙基葡萄糖醛酸苷 85.10 11.0 18.0 15.0 *表示定量离子 1.3样品前处理方法 1.使用 ATLAS 进行前处理：样品管中加入0.2mL样品，使用ATLAS-LEXT NHD 自定义程序进行蛋白沉淀，程序的详细步骤为：向样品中加入1.8 mL乙腈，移动样品瓶至混合离心单元，混合离心，取1mL上清液至干净试管中，0.22 um 滤膜过滤后上机。针对于 ATLAS 的专用软件流程设置如图2所示。 图2 ATLAS-LEXT NHD 样品前处理软件界面及处理流程设置 2.手动进行前处理：准确移取0.2mL样品于离心管中，加入1.8mL乙腈，涡旋90 s， 10000 r/min 离心3min，取上清液以 0.22 um 滤膜过滤后待测。 结果与讨论 2.1前处理方案性 蛋白沉淀法是血液和尿液等样品处理时常用的方法，常规处理方式多为手动模式，添加沉淀剂、涡旋、离心等步骤均需手动完成，在样品量较多时，存在耗时费力的问题，且人为失误时有发生。 在此前应用报告《LCMS-8045 测定血液和尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷》中，即采用了手动处理的模式，本文采用 ATLAS-LEXT NHD 对血浆样品进行自动蛋白沉淀，在同样的处理步骤和参数下，对比了手动和自动模式的效果，具体结果后文展示。 2.2重复性实验 浓度分别为 1 ug/mL 和10 ug/mL的基质加标样品以 ATLAS-LEXT NHD 各自处理6个平行样，进样分析考察方法的重复性，结果如表3所示，保留时间 RSD 在 0.11~0.16%之间，峰面积 RSD 在 2.88~4.96%之间，方法重复性良好。 表3 重复性测试结果 序号 目标物 加标示度(ug/mL) 保留时间 RSD，% 峰面积RSD，% 1 EtG 1 0.16 4.96 2 10 0.11 2.88 2.3加标回收率实验 浓度分别为 1 ug/mL 和 10 ug/mL的基质加标样品分别以 ATLAS-LEXT NHD 自动处理和手动处理，考察不同前处理方法的回收率。结果如表4所示，两种前处理方式加标回收率分别在78.1%~80.3%和79.4%~82.5%之间，两种前处理方式回收率无显著差异，自动处理重复性优于手动处理。 表4 加标回收率实验 处理方式 加标回收率(%) 浓度1 RSD% 浓度2 RSD% 自动处理 80.3 4.96 78.1 2.88 手动处理 79.4 8.73 82.5 6.54 图3 1 ug/mL加标样品色谱图 图4 加标回收率对比 2.4自动与手动前处理对比 单个样品分别以 ATLAS-LEXT NHD 自动处理和手动处理时，加入乙腈、混合、离心等单个步骤所需时间相近，处理单个样品所需时间基本相等。但ATLAS-LEXT NHD 搭载多通道混合离心装置，可支持最多6个样品同时处理，因此在大批量样品前处理时，可无人值守连续工作，提高效率。另自动前处理可降低人为失误，同时减少有机溶剂对实验人员造成的身体危害。 结论 本文建立了一种使用 ATLAS-LEXT NHD 自动前处理装置及液质联用仪测定血浆中乙醇标志性代谢物-乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的方法。实验结果表明：该方法重复性良好，不同浓度基质加标样品以 ATLAS-LEXT NHD各自处理6个平行样，保留时间RSD 在 0.11~0.16%之间，峰面积RSD 在2.88~4.96%之间；加标回收率在78.1%~80.3%之间。该方法具有自动化程度高、通量高、回收率和重复性好的特点，利用了ATLAS-LEXT NHD自定义编程功能进行蛋白沉淀，可减少人为操作带来的误差并和化学试剂暴露风险，可用于血样中 EtG的测定，供公安司法相关检测人员参考。 岛津应用云 本文建立了一种使用ATLAS-LEXT NHD自动前处理装置及液质联用仪测定血浆中乙醇标志性代谢物-乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）的方法。实验结果表明：该方法重复性良好，不同浓度基质加标样品以ATLAS-LEXT NHD各自处理6个平行样，保留时间RSD在0.11~0.16%之间，峰面积RSD在2.88~4.96%之间；加标回收率在78.1%~80.3%之间。该方法具有自动化程度高、通量高、回收率和重复性好的特点，利用了ATLAS-LEXT NHD自定义编程功能进行蛋白沉淀，可减少人为操作带来的误差并和化学试剂暴露风险，可用于血样中EtG的测定，供公安司法相关检测人员参考。