人血浆中羟氯喹检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-054Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-453 岛津应用云岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS法测定人血浆中硫酸羟氯喹的含量 LCMSMS-453 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱和三重四四杆质谱联用技术测定人血浆中硫酸羟氯喹的方法。人血浆样品经乙腈沉淀蛋白后可在10 min 内快速、准确地测定其中的硫酸羟氯喹含量。本文考察了方法的专属性、线性、定量限、重复性、基质效应；结果表明：硫酸羟氯喹在 0.5~500 ng/mL范围内线性良好，相关系数大于0.998；方法定量限为0.5 ng/mL；硫酸羟氯喹低、中、高浓度样品日内精密度在1.57~8.33%之间；准确度在97.91~106.02%之间；硫酸羟氯喹低、中、高浓度样品及内标的基质效应在98.31~108.17%之间。使用 LCMS-8050 系统，可快速、灵敏、稳定的对人血浆中硫酸羟氯喹含量进行测定。 关键词：三重四极杆液相色谱质谱联用仪人血浆 硫酸羟氯喹 新型冠状病毒爆发后，抗疟药物硫酸羟氯喹(中文别称：羟氯喹)被世界各国推荐用于临床治疗。此前，武汉大学人民医院的研究团队在预印本平台 medRxiv上公布了一项针对羟氯喹对新冠肺炎患者治疗疗效的临床试验结果。结果显示，有31名患者在接受标准治疗(氧疗、抗病毒药物、抗菌药物和免疫球蛋白以及使用或不使用糖皮质激素)的同时，额外接受5天口服羟氯喹治疗后，临床恢复时间方面的体温恢复时间和咳嗽缓解时间，都比只接受标准治疗对照组的患者显著缩短。此外，羟氯喹治疗组中有改善的肺炎患者比例更大。法国马赛大学医院研究所传染病学教授迪迪埃·拉乌尔特，在《国际抗菌剂杂志》上发表了其领导团队应用羟氯喹治疗新 冠病毒的临床测试结果。结果显示，在这项针对36位新冠肺炎患者的临床试验中，有6例在接受羟氯喹和阿奇霉素联合治疗后获得了100%的病毒学治愈，12例仅接受了羟氯喹治疗的患者也表现出了明显改善。据报道，羟氯喹已经于4月20日获批在美国投入临床试验，以检验它对新型冠状病毒是否有效。 本文采用岛津 LCMS-8050三重四极杆液相色谱质谱联用仪，建立了人血浆中硫酸羟氯喹测定的方法。该方法简便、灵敏度高、重复性好、线性范围广、无残留；可用于人血浆中硫酸羟氯喹浓度的评估，为临床施治提供参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-30AD(俞液泵)×2， DGU-20A5(在线脱气机)， SIL-30AC(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱))， CBM-20A (系统控制器)， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver 5.97(色谱工作站)。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：Shimpack GIST C18-AQ， 100 mm ×2.1 mml.D.， 1.9 um(SGLC， P/N： 227-30807-02) 流动相：A相-0.1%甲酸-50mM 乙酸铵水溶液；B相-甲醇：乙腈((1：1) 流速：0.50 mL/min 柱温：40℃ 洗脱方式：等度洗脱，B相浓度为20%。 质谱条件 离子化模式： ESI，正离子模式分析 加热模块温度：400℃离子源接口电压：4.5kV 接口温度：300℃雾化气：氮气3.0 L/min 干燥气：氮气10.0 L/min加热气：干燥空气10.0L/min MRM 参数：见表1 DL温度：250℃ 表11MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre 碰撞能量 Q3 Pre CAS No. [M+H]+ (m/z) Bias (V) CE(V) Bias(V) 硫酸羟氯喹 Hydroxychlorquine Sulfate 747-36-4 336.20 247.10* -12.0 -22.0 -28.0 158.15 -12.0 -36.0 -18.0 磷酸氯喹 Chloroquine diphosphate 50-63-5 320.20 247.10 -12.0 -22.0 -28.0 *代表定量离子对 1.3标准品与试剂 甲醇： Merck 公司，色谱级，室温保存。 乙： Merck公司，色谱级，室温保存。 乙酸铵： Merck 公司，色谱级，室温保存。 DMSO：成都科龙化工有限公司，分析纯，室温保存。 实验用水：由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：购自安谱公司，色谱级，纯度98%，室温保存。 1.4对照品溶液及内标溶液的配制 硫酸羟氯喹标准储备液：精密称定硫酸羟氯喹标准对照品，用甲醇水溶液(体积比1：1)溶解并稀释至10.0 ug/mL，于-20℃冰箱避光保存，备用。 硫酸羟氯喹工作溶液：吸取适量硫酸羟氯喹储备液用甲醇水溶液(体积比1：1)配制成浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000 ng/mL工作液；至适宜容器中于-20℃冰箱避光保存，备用。 磷酸氯喹(内标)标准储备液：精密称定磷酸氯喹标准对照品，用甲醇水溶液(体积比1：1)溶解，至适宜容器中于4℃冰箱保存备用。 磷酸氯喹(内标)标准工作溶液：用甲醇水溶液(体积比1：1)配制浓度为1000 ng/mL工作液，至适宜容器中于4℃冰箱保存，备用。 1.5样品制备 标准曲线样品：取人血浆95uL， 加入5uL标准混合对照工作液，，10 uL内标工作液，涡旋混合30s后加入400 uL乙腈，涡旋混合1 min 后于 14000 rpm 离心10 min；取上层清液300 pL， 以2 uL 进样 LC-MS/MS分析。 质控样品：取人血浆95uL， 加入5 uL硫酸羟氯喹质控工作液(浓度为5、200、4000 ng/mL)、其余处理过程同标准曲线样品。 基质样品：人血浆95 uL， 400 uL乙腈涡旋混合1min， 加入5uL质控工作液(浓度为5、200、4000ng/mL)、10uL内标工作液，其余处理过程同标准曲线样品。 工作液样品：取纯水95uL， 加入5uL质控工作液(浓度为5、200、4000 ng/mL)、其余处理过程同标准曲线样品。 结果讨论 2.1选择性 取空白人血浆100uL， 按照样品处理方法制备，结果如图1~2所示。结果显示，人空白血浆中目标化合物硫酸羟氯喹及内标磷酸氯喹保留时间处监测通道无显著性干扰。 图1空白血浆及含硫酸羟氯喹血浆样品(200ng/mL) 图2空白血浆及含磷酸氯喹血浆样品(100ng/mL) 2.2线性范围 图3码硫酸羟氯喹血浆校准曲线 人血浆配制校准曲线样品浓度分别为 0.5 ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL。标准曲线如图3所示，线性方程及相关系数见表2，其中y值代表待测物质与内标物质峰面积的比值，x值代表血浆中待测物质浓度比。 表22硫酸羟氯喹校准曲线参数(线性回归，权重为1/C) 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 硫酸羟氯喹 Y=(0.00140144)X+(0.000398161) 0.5~500 90.6~110.0 0.9988 2.3基质效应 基质效应考察结果如表3所示。 表3基质效应(n=3) 浓度水平 基质效应(%) 理论浓度(ng/mL) 硫酸羟氯喹 LOQ 0.5 108.17 MQC 20 105.52 HQC 400 98.31 内标 105.72 结果表明，硫酸羟氯喹及内标的基质效应在98.31~108.17%之间。 2.4精密度与准确度 考察三个浓度水平质控样品的日内精密度，结果如表4所示。 表4方法精密度与准确度(n=6) 待测物质/样品浓度 (ng/mL) 精密度 RSD% 准确度 Accuracy% 0.5 8.33 106.02 硫酸羟氯喹 20 5.19 101.83 400 1.57 97.91 结果表明，硫酸羟氯喹日内精密度在1.57~8.33%之间；准确度在97.91~106.02%之间。 2.5进样盘稳定性 考察三个浓度水平质控样品处理后进样盘中放置稳定性(6℃、10h)，结果如表5所示。 表5进样盘稳定性(n=6) 待测物质/样品浓度 (ng/mL) 精密度 RSD% 准确度 Accuracy% 0.5 7.33 94.72 硫酸羟氯喹 20 4.56 98.01 400 1.76 96.30 结果表明，硫酸羟氯喹于进样盘6℃放置10h内稳定。 结论 硫酸羟氯喹在 0.5~500 ng/mL 范围内线性良好，相关系数大于0.998；方法定量限为 0.5 ng/mL；硫酸羟氯喹低、中、高浓度样品日内精密度在1.57~8.33%之间；准确度在97.91~106.02%之间；硫酸羟氯喹低、中、高浓度样品及内标的基质效应在98.31~108.17%之间。使用 LCMS-8050系统，可快速、灵敏、稳定的对人血浆中硫酸羟氯喹含量进行测定。 羟氯喹在0.5~500 ng/mL范围内线性良好，相关系数大于0.998；方法定量限为0.5 ng/mL；羟氯喹低、中、高浓度样品日内精密度在1.57~8.33%之间；准确度在97.91~106.02%之间；羟氯喹低、中、高浓度样品及内标的基质效应在98.31~108.17%之间。使用LCMS-8050系统，可快速、灵敏、稳定的对人血浆中羟氯喹含量进行测定。