血清中11种镇静剂含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-234Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-485 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn ATLAS-LEXT 和 LCMS-8050联用检测血清中11种镇静剂含量 LCMSMS-485 摘要：：本文利用 ATLAS-LEXT 和 LCMS-8050联用，建立了血清中11种镇静剂的分析方法。该方法最大特点为利用 ATLAS-LEXT 自定义编程功能-双步萃取，大大简化前处理流程。同时实验结果表明：该方法线性良好；对高、中、低水平的标准溶液重复进样10针，保留时间和峰面积重复性良好。加标回收实验中，各物质回收率在53.4~87.0%之间，平行3份样品的峰面积RSD%值分别在0.28~10.7%之间，表明 ATLAS-LEXT 回收及精密度良好。该方法为血清中镇静剂的检测提供很好的参考。 关键词： ATLAS-LEXTTLCMS-8050 11种镇静剂 血清 镇静剂是指可减少某些器官或组织活性，抑制中枢神经系统以起镇静作用的药物。主要分为苯二氮卓类和巴比妥类两类。近些年来，不法分子使用镇静剂犯罪屡见报道，成为受关注的社会问题，公安系统对于镇静剂犯罪的打击越发严格。其中，尿液、汗液、唾液及毛发等生物样品中的毒物药物检测是确认案件的重要依据。由于这类样品的基质均比较复杂，因此在分析前通常需要对样品进行前处理。常见的前处理方法有固相萃取、固相微萃取、液-液萃取等，这些方法通常较为繁琐，耗时耗力。 岛津公司 ATLAS-LEXT 自动前处理装置可以对唾液、尿液、血液等样品中的违禁药物自动进行液-液萃取，复溶后可进行液质或气质联用分析，自动化程度高，可节省大量时间，提高效率。同时 ATLAS-LEXT可根据前处理需要进行自定义编程，从而完美实现复杂前处理步骤，包括多次萃取，中性酸性碱性萃取等。 本文利用岛津 ATLAS-LEXT和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用，通过 ATLAS-LEXT编程功能，建立血清中11种镇静剂的检测方法，供相关人员参考。 岛津 LCMS-8050三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A 脱气机： DGU-20A5输液泵： LC-30AD×2自动进样器： SIL-30AC柱温箱： CTO-20AC检测器：LCMS-8050 色谱工作站：LabSolutions Ver.5.97 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：InertSustain AQ-C18 (100 mm L×2.1 mm l.D.， 1.9 um， Shimadzu SGLC P/N： 5020-89939) 流动相：A相-0.1%甲酸水B相-乙腈 流速：0.35 mL/min 柱温：40℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相相始浓度为20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 6.0 泵 B.Conc 100 7.0 泵 B.Conc 100 7.1 泵 B.Conc 20 10.0 控制器 Stop LCMS-8050质谱条件： 离子源： ESI(+) 雾化气流速：3L/min DL 温度：250℃接口温度：300℃ 加热气流速： 10L/min加热模块温度：400℃扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气流速：10L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 No. 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 阿普唑仑 309.20 281.20 -14 -26 -30 205.15 -14 -41 -21 2 氯氮平 327.20 270.20* -16 -24 -28 192.20 -15 -44 -20 3 硝西泮 282.15 236.20* -11 -25 -25 180.20 -11 -18 4 劳拉西泮 321.15 275.15 -15 -30 303.05 -11 -16 -15 5 艾司唑仑 295.15 267.20' -12 -26 -27 205.20 -13 -41 -20 6 氟硝西泮 314.15 268.25 -13 -27 -27 239.20 -12 -36 -24 咪哒唑仑 326.15 291.25’ -26 -28 -14 249.15 -14 -38 -25 8 奥沙西泮 287.15 241.15* -12 -21 -24 269.15 -12 -15 -13 9 三唑仑 343.15 308.20* -10 -27 -22 239.15 -10 -41 -16 10 氯硝西畔 316.15 270.15* -10 -24 -28 214.10 -14 -39 -22 11 地西泮 285.15 193.20* -12 -32 -19 154.15 -13 -27 -16 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 取浓度为1.0 mg/L对照品混合溶液，以 ATLAS-LEXT 处理的血清空白基质作为稀释溶剂，依次配制成0.2、0.5、1、2、5、10、20 ug/L的系列浓度，待上机分析。 1.4样品前处理方法 在样品管中加入0.5mL血清， 采用 ATLAS 自定义程序进行液液萃取。萃取流程：向样品中依次加入0.5mL的水、2mL的乙酸乙酯，震荡离心中性提取后进行乳化检测，之后取1.5 mL上清液到干净样品管中，随后在萃取后的样品中再加入50 uL的1M氢氧化钠溶液、1.5 mL的乙酸乙酯进行萃取，震荡离心碱性提取后进行乳化检测。之后取 1.5 mL 上清液合并到干净样品管中。干燥完成后加入甲醇复溶， 0.22 um 滤膜过滤上机分析。 氮吹/真空干燥 图11AATLAS-LEXT 样品处理流程图 结果与讨论 2.1标准品 MRM色谱图 图2镇静剂标准品 MRM色谱图(5ug/L) 2.2线性范围 按照1.3配制成各浓度标准溶液，以各目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，以外标法绘制标准曲线，所得校准曲线线性关系良好，线性相关系数大于0.995，准确度在80.0~119.8%之间。曲线结果如下图3所示。线性方程及相关系数见表3. Area Area阿普唑仑 ]氯氮平 硝西胖9y=177468.1x+6242.455 .y=657692.4x-860.7986 y=287041.6x+1365.226：R2=0.9954829 R/0.9977 1.000e7R=0.9974916 R/0.9987 ]R2=0.9996928R=0.99984.000e66-Curve Fit： Default (Linear) Curve Fit： Defauk (Linear) Curve Fit： Default (Linear)Weighting：fault (1/C) Weighting：Dfault (1/C) Weighting： Dofault (1/C)]Zero： Default (Not Forced)Zero： Default (5.000e6Not Forced) .Zero： Defaut (Not Forced)2.000e61.000e66-0.000e0 0.000e00 0 10 0 10Conc. (ppb) Conc.(ppb) Conc.(ppb)阿普唑仑 氯氮平 硝西泮AAreraea4.000e6-艾司唑仑氟硝西泮2.000e6-劳拉西半-y=198940.1x-3641.712y=237185.4x-13660.91y=105335.8x+4780.156 4.000e6-R2=0.9979403 R=0.998R2=0.9973863R/0.9986-R2=0.9996339R=0.9998Curve Fit： Default (Linear)Curve Fit： Default (Linear)Curve Fit： Default (Linear) Weighting：Dofault (1/C)Weighting：Dfault (1/C) 2.000e6Weighting： Default (1/C)Zero： Default (Not Forced)Zero： Defaul (Not Forced) 2.000e6-Zero： DefayKt (Not Forced)0.000e00.000e0 厂T0 101010Conc. (ppb)Conc. (ppb) Conc. (ppb)劳拉西泮 艾司唑仑 氟硝西泮 氯硝西畔 地西泮 图3 毒品标准曲线 表3 校准曲线参数(1/C) No. 名称 校准曲线 相关系数 精确度 检测限 (ug/L) 定量限(ug/L) 1 阿普唑仑 Y=(177468)X+(6242.46) 0.9977 80.0-111.5 0.01 0.03 2 氯氮平 Y=(657692)X+(-860.799) 0.9987 86.2-105.3 0.01 0.03 3 硝西泮 Y=(287042)X+(1365.23) 0.9998 96.4-104.8 0.01 0.03 4 劳拉西泮 Y=(105328)X+(4359.41) 0.9987 96.6-111.7 0.06 0.17 5 艾司唑仑 Y=(198940)X+(-3641.71) 0.9998 93.8-103.9 0.01 0.02 6 氟硝西泮 Y=(237185)X+(-13660.9) 0.9990 87.0-114.5 0.01 0.04 7 咪哒唑仑 Y=(403889)X+(1802.27) 0.9994 98.1-109.3 0.01 0.03 8 奥沙西泮 Y=(227969)X+(-3312.87) 0.9998 96.8-112.2 0.02 0.07 9 三唑仑 Y=(177845)X+(-2215.78) 0.9997 97.3-103.7 0.003 0.01 10 氯硝西畔 Y=(109774)X+(-4173.10) 0.9989 87.4-118.7 0.07 0.22 11 地西泮 Y=(124087)X+(12921.8) 0.9983 81.9-119.8 0.01 0.03 2.3重复性考察 按照1.3步骤配制低、中、高三个浓度标准溶液，连续进样10次，考察分析方法保留时间和峰面积的重复性。结果表明：11种镇静剂保留时间的 RSD 均小于0.13%和峰面积的 RSD 均小于7.98%，方法重复性良好，仪器精密度良好。结果见表 4。 表4重复性测试(n=10) 样品名称 RSD%6 (1ug/L) RSD%(5ug/L) RSD%0( (20ug/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 阿普唑仑 0.03 3.61 0.07 2.67 0.09 1.59 氯氮平 0.06 3.51 0.09 4.40 0.13 2.21 硝西泮 0.04 3.85 0.07 2.63 0.09 2.20 劳拉西泮 0.02 4.71 0.07 2.74 0.10 2.90 艾司唑仑 0.04 3.47 0.06 2.46 0.09 1.43 氟硝西泮 0.02 7.98 0.06 1.95 0.08 2.75 咪哒唑仑 0.06 2.22 0.08 3.55 0.11 2.99 奥沙西泮 0.03 4.37 0.07 2.71 0.09 2.87 三唑仑 0.03 4.19 0.06 1.62 0.09 1.96 氯硝西畔 0.04 6.62 0.06 4.10 0.09 1.74 地西泮 0.02 6.44 0.06 3.14 0.08 1.16 2.4加标回收实验 取血清，按照1.4步骤中制备样品和加标样品，高中低3个水平加标浓度如下表5所示，各浓度平行处理4份。测试结果显示：通过两步提取，各水平的平均加标回收率在53.4~87.0%之间，相对标准偏差在0.28~10.7%之间。 表5基质加标实验结果(n=4) 样品名称 样品浓度(ug/L) 加标(1ug/L) RSD% (5ug/L) RSD% (20ug/L) 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 阿普唑仑 N.D. 69.0 9.61 79.6 4.88 68.5 10.7 氯氮平 N.D. 64.0 10.1 62.2 0.28 60.7 10.3 硝西泮 N.D. 65.0 4.32 63.0 4.63 60.3 8.12 劳拉西泮 N.D. 58.0 7.98 62.2 3.82 59.0 7.29 艾司唑仑 N.D. 70.0 8.02 81.2 2.23 78.8 5.90 氟硝西泮 N.D. 76.0 2.69 60.8 8.07 53.4 9.49 咪哒唑仑 N.D. 87.0 5.80 85.6 4.46 81.4 5.67 奥沙西泮 N.D. 70.0 6.93 66.2 3.08 63.0 5.69 三唑仑 N.D. 84.0 4.48 80.4 3.76 78.2 5.78 氯硝西畔 N.D. 82.0 9.35 65.0 7.33 60.4 7.43 地西泮 N.D. 74.0 7.84 65.2 6.16 64.2 8.74 结论 本文利用岛津 ATLAS-LEXT 自定义前处理程序功能-双步萃取，同LCMS-8050联用，建立一种简便、快速、准确的血清中11种镇静剂的分析方法。该方法采用外标法定量，在 0.2-20 ug/L的范围内，各组分线性相关系数均在0.995以上，线性良好。对高、中、低水平的标准溶液重复进样10针，保留时间和峰面积均表现出了良好的重复性。加标回收实验中，各物质回收率在53.4~87.0%之间，平行4份样品的峰面积RSD% 值分别在 0.28~ 10.7%之间， ATLAS-LEXT 回收及精密度良好。该方法操作简捷，为血清中镇静剂的检测提供很好的参考。 岛津应用云 本文利用岛津ATLAS-LEXT自定义前处理程序功能-双步萃取，同LCMS-8050联用，建立一种简便、快速、准确的血清中11种镇静剂的分析方法。该方法采用外标法定量，在0.2-20 μg/L的范围内，各组分线性相关系数均在0.995以上，线性良好。对高、中、低水平的标准溶液重复进样10针，保留时间和峰面积均表现出了良好的重复性。加标回收实验中，各物质回收率在53.4 ~ 87.0%之间，平行4份样品的峰面积RSD%值分别在0.28~ 10.7%之间，ATLAS-LEXT回收及精密度良好。该方法操作简捷，为血清中镇静剂的检测提供很好的参考。