临床质谱检测血清中9种水溶性维生素

使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8050 CL，建立了血清中9种水溶性维生素的检测方法。使用校准品及质控进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，质控测定准确度结果与精密度结果均符合要求。临床样品检测结果显示，方法适用性良好。该方法简便快速、准确可靠，可供相关从业人员参考。SSL-CA23-159Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-773 临床质谱检测血清中9种水溶性维生素 LCMSMS-773 摘要：使用岛津临床质谱建 立 了血清中9种水溶性维生素的检 测 方法。该方法线性良好，校准曲线相关系数 均大 于 0.99；质控 测 定的准确度均在89.90%~105.40%之间；质控 测 定的精密度 RSD 均在1.02%~4.69%之间。该方法检测效率高、准确性好、可 靠性出色，可用于人体内水溶性维生素的精准检测，为临床医学提供参考依据。 关键词：临床质谱 血清 水溶性维生 素 技术特点： 必前处理简便快捷，仅需简单蛋白沉淀即可上样分析。 *一针法同时 测 定9种水溶性维生素。 维生素是维持人体正常生理功能的微量有机物 质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥重要作用。水溶性维生素是维生素的一类，可溶于水 而 不溶于有 机溶剂 ，在人体内不需消化，直接从肠道吸收后，通 过循环到达机体需要的组织中，多余的部分大多由泌 尿系统排出。 水溶性维生素 主 要由八种B族维 生 素和维 生 素C 组成。维生素B1，即硫胺素，也 叫 抗神经炎素，具 有维持正常糖代 谢 的作用。维生素B2，即核黄素，主 要以辅酶形式参与氧化还原反应。维 生 素B3， 有 烟酸和烟酰胺两种形式，在人体内可相互转化，烟酰 胺(NAM)是辅酶|和辅酶Ⅱ的组成部分，作为许多 脱氢酶的辅酶，缺乏时可影响细胞 的 正常呼吸和代谢 而引起糙皮病。维生素B5，即泛酸，可在人体内转 变成辅酶A或酰基载体蛋白参 与脂 肪酸代谢反应。维 生 素B6，即吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在人体中上述物质约90%很快转变为代谢产物吡哆 酸(PA)；临床上应用维生素B6制剂防治妊娠呕 吐 和放射病呕吐。维 生 素B7，即生物素，是脂肪和蛋 实验部分 白质正常代谢不可或缺的物质。维 生 素B9，即叶 酸 ，在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作 用，对正常红细胞的形成有促进作用，而 在血清中主 要以5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的活 性 形式发挥作用。维生素B12，即钴胺素，特指氰钴胺，稳定性最好，此外还有甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺等形式，参 与 制 造骨髓红细胞，具有防止恶性贫血，防止大脑神经受 到破坏的生理作用。维生素C，即抗坏血酸，参与机 体复杂的代谢过程，能促进生长和增强对疾病的抵抗 力，可用作营养增补剂、抗氧化剂。 水溶性维生素的检 测 主要包括微生物法、光度法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、液相色谱法和液 相色谱 -质谱联用等方法。而质谱法目前是公认的“金 标准”。 本文使用岛津液相色谱 -三重四极杆质谱联用仪 LCMS -8050 CL 建立了血清中9种水溶性维生素的测 定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于人体内水溶性维生素的精准检 测 。 1.1仪器 本实验使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS -8050 CL。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A CL 在线脱气机：：DGU-20A5R CL 输 液 泵 LC -30AD CL×2柱温 箱 CTO-30A CL 自动进样器 SIL -30ACM P CL 质谱 仪：LCMS -8050 CL 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱：SShim-pack GIST-HP 2.1×100 mm(HSS)， 1.9 um C18-AQ； P/N： 227-30807-02；岛津(上海)实验器材有限公司 流 动 相： A-0.1%甲 酸 水溶液(含2mM乙酸铵) B-0.1%甲酸甲醇溶液(含2mM乙酸铵) 进样体 积 10 pL 柱 温：45℃：流 速 0.3 mL/min 洗 针液：甲醇/水=1：1(v：v) 洗脱方式： 梯度洗脱，B相起始浓度为1%，时间程序如表1所示。 表1 梯度洗脱时间程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 1.5 泵 B.Conc 1 2.00 泵 B.Conc 40 4.80 泵 B.Conc 40 4.81 泵 B.Conc 98 8.00 泵 B.Conc 98 8.01 泵 B.Conc 1 11.00 控制器 Stop 质谱条件 离子化模式：ESI+ 雾化气流速：3.0L/min 接口电压：4.5kV 接口温 度 ：350℃ 充速：5.0L/min 加热气流 充速 速：：9.0L/min DL温 度：1150°C 碰 撞 气：氩 气 加热模块温度：400℃ 扫描模式：多反应 监 测 (MRM) MRM 参 数：见见表2 表2 MRM 参数 ID 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 维生素 B1 265.20 122.15 -12 -13 -12 2 维生素B1-D3 268.20 122.05 -12 -13 -12 3 维生素 B2 377.30 243.20 -18 -23 -24 4 维生素 B2-D6 383.15 249.20 -18 -23 -24 5 维生素 B3-NAM 123.00 80.10 -12 -21 -13 6 维生素 B3-NAM-D4 127.10 84.10 -12 -21 -13 7 维生素 B5 220.20 90.05 -24 -14 -14 8 维生素B5-D4 224.20 94.20 -24 -14 -14 9 维生素 B6-PA 184.20 148.05 -19 -21 -14 10 维生素 B6-PA-D3 187.20 150.15 -19 -21 -14 11 维生素 B7 245.20 227.20 -12 -13 -22 12 维生素B7-D2 247.20 229.10 -12 -13 -22 13 维生素 B9-5-MTHF 460.00 313.10 -22 -20 -20 14 维生素 B9-5-MTHF-D4 464.30 317.25 -22 -20 -20 15 维生素 B12 678.40 147.15 -24 -47 -14 16 维生素C 177.20 141.10 -18 -9 -13 17 维生素 C-D6 183.06 100.11 -18 -9 -13 1.3替代基质溶液的配制 精确称取 BSA (牛血清白蛋白) 0.5g， NaCl 0.9 g， DTT(二硫苏糖醇) 0.02g充分溶解于适量纯化水中，将溶液倒入100 mL容量瓶 中 ，加纯化水定容至刻度。使用 0.22 um 滤膜过滤后即得替代基质溶液。 1.4校准品溶液的配制 校准储备溶液：精确称取标准品适量，用含0.1%甲酸， 及0.2 g/L DTT 的水溶液配制成含不同浓度维生素 的混合储备溶液，具体浓度见表3。 表3标准储备溶液浓度 序号 成分名称 浓度(ug/mL) 序号 成分名称 浓度(ug/mL) 1 维生素 B1 20 6 维生素 B7 10 2 维生素 B2 50 7 维生素 B9-5-MTHF 50 3 维生素 B3-NAM 200 8 维生素 B12 10 4 维生素 B5 200 9 维生素C 50000 5 维生素 B6-PA 50 校准工作溶液：取适量标准储备溶液，用替代基质溶液逐级稀释，配制成不同浓度的工作溶液，具体浓度见 表4。(注：校准工作溶液建议现配现用) 表4标准 工 作溶液浓度 序号 成分名称 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 1 维生素 B1 0.31 0.63 1.25 2.50 5.00 10.00 20.00 2 维生素 B2 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 3 维生素 B3-NAM 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00 4 维生素 B5 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00 5 维生素 B6-PA 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 6 维生素 B7 0.16 0.31 0.63 1.25 2.50 5.00 10.00 7 维生素 B9-5-MTHF 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 8 维生素 B12 0.16 0.31 0.63 1.25 2.50 5.00 10.00 9 维生素C 780 1560 3130 6250 12500 25000 50000 1.5内标溶液的配制 内标储备溶液：使用含0.1%甲酸，及 0.2 g/L DTT的水溶液制成浓度为1mg/mL的每种内标的单储备溶液。 内标中间溶液：使用含0.1%甲酸，及 0.2 g/L DTT 的水溶液稀释内标储备溶液，配 制 成含不同浓度维生素 内标的混合中间溶液，具体浓度见表5。 表 5内 标 中间溶液浓度 序号 成分名称 浓度(ug/mL) 序号 成分名称 浓度(ug/mL) 1 维生素 B1-D3 2.5 5 维生素 B6-PA-D3 6.25 2 维生素B2-D6 6.25 6 维生素 B7-D2 1.25 3 维生素 B3-NAM-D4 25 7 维生素 B9-5-MTHF-D4 6.25 4 维生素 B5-D4 25 8 维生素 C-D6 6250 内标工作溶液：使用10%三氯乙酸(w/v))将内标中间溶液稀释1000倍，制成内标工作溶液，直接用于前 处理操作 。(注：内标工作溶液建议现配现用) 1.6质控品溶液的配制 质控储备溶液：精确称取标准品适量，用含0.1%甲 酸 ， 及 0.2 g/L DTT 的 水溶液配制成含不同浓度维生素 的混合储备溶液，具体浓度见表6。 表6质 控 储备溶液浓度 序号 成分名称 浓度(ug/mL) 序号 成分名称 浓度 (ug/mL) 1 维生素 B1 10 6 维生素 B7 5 2 维生素 B2 25 7 维生素 B9-5-MTHF 25 3 维生素 B3-NAM 100 8 维生素 B12 5 4 维生素 B5 100 9 维生素C 25000 5 维生素 B6-PA 25 质控 工 作溶液：取适量质控储备溶液，用替代基质溶液分别稀释2500倍和1000倍，配制成高低两浓度的 工作溶液，具体浓度见表7。((注：质控工作溶液建议现 配 现用) 表7质控 工 作溶液浓度 序号 成分名称 浓度(ng/mL) 序号 LQC HQC 成分名称 浓度((ng/mL) LQC HQC 1 维生素 Bl 4 10 6 维生素 B7 2 5 2 维生素 B2 10 25 7 维生素 B9-5-MTHF 10 25 3 维生素 B3-NAM 40 100 8 维生素 B12 2 5 4 维生素 B5 40 100 9 维生素C 10000 25000 5 维生素 B6-PA 10 25 1.7样品前处理 取校准工作溶液、质控工作溶液以及血清样品(提前加入终浓度 0.2 g/L的 DTT) 各150 uL 于棕色 1.5mL 离心管中，分别加入100 uL内标工作溶液，漩涡振荡 5 min。然后13000 rpm 离心10 min， 取上清液于棕色1.5mL进样瓶中，上机检测 。 ■结果讨论 2.1 MRM 色谱图 Q265.2000>122.1500(+) 9.67e3 5.0e3- 0.0e00- 3.0 3.5 4.0 RT (min) 维 生 素 B9-5-MTHF (0.78ng/mL ) Q123.0000>80.1000(+) 6.37e4 5.0e41- 0.0e0 元 一 一 0.5 1.0 1.5 2.0 RT (min) 维生素C (0.78 u g/mL) 对校准 工 作溶液按1.7中前处理条件进行处理，按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作校准 曲 线。9种 水溶性维生素的校准曲线见图2，校准曲线统计结果见表8。 Area Ratio Area Ratio Area Ratio 3.0- 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0· Area Ratio Area Ratio 维生素 B5 维生素 B6-PA 维生素B7 Area Ratio Area Ratio Area Ratio 维生素B9-5-MTHF 30维生素C ly =0.6045633x+0.05269808 1R2=0.9991845 R=0.9995922 维生素 B9-5-MTHF 维生素 B12 维生素C 图2 9种 水溶性维生素的校准曲线 表8校准曲线统 计 结果 序号 化合物名称 线性范围 (ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 维生素 B1 0.31~20.00 0.9997 88.91%~105.45% 2 维生素 B2 0.78~50.00 0.9986 87.20%~107.21% 3 维生素 B3-NAM 3.13~200.00 0.9987 87.34%~110.37% 4 维生素 B5 3.13~200.00 0.9989 88.09%~108.68% 5 维生素 B6-PA 0.78~50.00 0.9988 94.21%~105.78% 6 维生素 B7 0.16~10.00 0.9987 86.35%~110.41% 7 维生素 B9-5-MTHF 0.78~50.00 0.9994 92.34%~105.45% 8 维生素 B12 0.16~10.00 0.9994 88.74%~105.37% 9 维生素C 780~50000 0.9996 93.80%~105.00% Q265.2000>122.1500(+) 图 3 临床样品 Sample-01谱图 表10临床样品检 测 结果 (ng/mL) 序号 化合物名称 Sample-01 Sample-02 Sample-03 1 维生素 B1 1.31 1.35 0.85 2 维生素 B2 12.29 15.73 7.19 3 维生素 B3-NAM 40.48 25.35 16.79 4 维生素 B5 44.99 42.38 46.01 5 维生素 B6-PA 2.57 1.81 2.09 6 维生素 B7 0.66 0.50 0.38 7 维生素 B9-5-MTHF 4.84 3.87 4.61 8 维生素 B12 0.56 0.08 0.13 9 维生素C 4710 4110 5320 结论 使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8050 CL，建立了血清中9种水溶性维生素的检测方法。使用校准品 及质控进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，质控测定准确度结果 与 精密 度 结果均符合要求。临 床样品检测结果显示，方法适用性良好。 该方法简便快速、准确可靠，可供相关从业人员参考。 岛津应用云