血浆中使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺检测方案(液相色谱仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺 Gareth Hammond'、Michelle Wills1、Lisa J. Calton1、Kim Haynes? 沃特世公司(英国威姆斯洛)，?沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 更快速、更简单的样品制备工作流程 与蛋白沉淀法相比，可去除至少98%的磷脂 无需蒸发或复溶 沃特世解决方案 Oasis" PRiME MCXuElution板 ACQUITY UPLCI-Class系统(FTN) ACQUITY UPLC CSH C.. 130A， 1.7 um，2.1x100mm色谱柱 Xevo""TQD质谱仪MassLynx"软件 Oasis MCX uElution板 关键词 Oasis PRiME MCX， SPE， 普萘洛尔，多虑平，洛哌丁胺，磷脂去除，LC-MS/MS 简介 生物分析在药物发现和开发中发挥着重要作用，其中样品制备是获得可靠结果的关键步骤。为实验室开发高通量分析方法时，分析速度、方法稳定性和成本是必须考虑的重要因素。 Oasis PRiME MCX是一款混合模式/强阳离子交换固相萃取(SPE)产品，相较于其他样品制备技术，该产品可通过去除磷脂萃取出更洁净的碱性化合物。在本应用纪要中，我们使用96孔uElution板，通过快速的3步和4步方案(省去了传统固相萃取法(SPE)的活化和平衡步骤)成功萃取了人血浆中的分析物。 普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺的结构和性质如表1所示。这些分析物的分子量较小且pKa在9.41~9.76范围内，因此适合采用反相色谱进行分离，并通过电喷雾阳离子质谱进行检测。 pKa较高也意味着这些药物适合采用阳离子交换吸附剂进行样品制备。 表1.普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺的结构和性质。 化合物 结构 分子式 分子量 pKa OH普萘洛尔 C16H2NO， 259.35 9.67 O 多虑平 C19H2NO 279.38 9.76 洛哌丁胺 O H C29H33CIN202 477.05 9.41 CI 在本应用纪要中，我们使用四种样品萃取方案(蛋白沉淀法、Oasis MCX、 Oasis PRiME MCX3步方案和Oasis PRiME MCX 4步方案)对三种药物进行分析，比较了这四种方法的回收率和基质效应(包括磷脂去除率)。 样品制备 将普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺(Sigma Aldrich， 英国多塞特郡)加标至混合人血浆(Sera Laboratories， 英国西萨塞克斯郡)中，制得浓度在1.0~100 ng/mL范围内的加标样品。另外，自制浓度为7.5、30和75 ng/mL(分别代表低、中、高QC浓度)的质控(QC)样品。 1.蛋白沉淀法 将血浆样品/QC样品(100pL)转移到有刻度的微量离心管中。加入甲醇(300pL)使蛋白质沉淀。离心管加盖涡旋30s， 然后在13000 rpm的转速下离心5 min。 2.Oasis MCX 将血浆样品/QC样品(100pL)转移到有刻度的微量离心管中。向样品中加入4%磷酸(100pL)，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。离心管加盖涡旋30s，然后在13000 rpm的转速下离心5 min。将上清液转移至已经过甲醇活化并用水进行了平衡的96孔Oasis MCX uElution板中。依次用2%甲酸水溶液和100%甲醇清洗萃取板。再用5%的氨化甲醇溶液(25pL)洗脱2次，再用水(50pL)洗脱。 在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s. 3.Oasis PRiME MCX (4步方案) 将血浆样品/QC样品(100pL)转移到有刻度的微量离心管中。向离心管中加入4%磷酸(100uL)，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。 离心管加盖涡旋30s， 然后在13000 rpm的转速下离心5min。将上清液移入96孔Oasis PRiME MCX uElution板中，用清洗溶液1(含2%甲酸的100mM甲酸铵)和清洗溶液2(100%甲醇)进行清洗。然后用5%的氨化甲醇溶液(25pL)洗脱2次， 再用水(50uL)洗脱。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s。 4.Oasis PRiME MCX (3步方案) 将血浆样品/QC样品(100pL)转移到有刻度的微量离心管中。向离心管中加入含4%磷酸的200mM甲酸铵(100pL)，以破坏蛋白质结合，同时使分析物质子化，促进离子交换相互作用。 离心管加盖涡旋30s， 然后在13000 rpm的转速下离心5 min。将上清液移入96孔Oasis PRiME MCX uElution板中，使用100%甲醇进行清洗。然后用5%的氨化甲醇溶液(25pL)洗脱2次， 再用水(50uL)洗脱。在分析之前，将样品板密封并轻轻涡旋30 s. 图1.与传统SPE萃取方案比较， Oasis PRiME MCX样品萃取方案由于省去了活化和平衡步骤，被简化为仅有3步或4步。 LC条件 MS条件 LC系统：ACQUITY UPLC I-Class系统(FTN)系统： Xevo TQD色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C，130A，分辨率： MS1和MS2 (0.75 FWHM)1.7 pm， 2.1x100 mm(部件号186005297)采集模式： 多重反应监测(MRM)(详见表3)流动相A：0.1%甲酸的水溶液极性： ESI正离子模式流动相B：甲醇毛细管电压： 1.0 kV清洗溶剂：80%甲醇水溶液和0.1%甲酸锥孔电压： 见表3清除溶剂：20%甲醇水溶液和0.1%甲酸离子源温度： 150°C密封清洗液：20%甲醇水溶液脱溶剂气温度： 600℃柱温：45°℃脱溶剂气流速： 1000 L/h样品温度：10°℃锥孔气体流速： 100 L/h进样体积：10pL驻留时间： 0.02 s梯度：见表2扫描间延迟时间：0.02s运行时间：5.0 min(进样之间间隔约5.0 min)通道间延迟时间：0.01s 表2.色谱分离梯度表。 表3.MRM参数指南。 时间 流速 A B 曲线 (min) (mL/min) (%) (%) 初始 0.4 90 10 初始 3.00 0.4 5 95 6 3.50 0.4 90 10 11 分析物 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能量 (m/z) (m/z) (V) (eV) 普萘洛尔 260.3 116.1 38 18 多虑平 280.3 107.0 40 24 洛哌丁胺 477.3 266.1 46 26 数据管理 带XS应用软件的MassLynx°4.1版。 结果与讨论 回收率和精度 分析代表了整个浓度范围的三个QC样品，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX、Oasis PRiME MCX 4步方案和Oasis PRiME MCX 3步方案的样品萃取回收率。使用如下公式计算萃取回收率： 三种分析物的结果表明， Oasis PRiME MCX(3步方案)、Oasis PRiME MCX(4步方案)和Oasis MCX都获得了良好的萃取回收率(总体平均回收率%为81.2~99.1)和精度(%RSD范围为3.1~9.3)。蛋白沉淀法也获得了良好的精度(%RSD范围为7.8~8.6)，但其%回收率比任何一种Oasis MCX样品制备方案都低(总体平均%回收率为30.7~32.1)(表4)。 表4.蛋白沉淀法、Oasis MCX、 Oasis PRiME MCX(4步方案)和Oasis PRiME MCX(3步方案)的精度(%RSD)和萃取回收率(%回收率)。 QC低浓度 普萘洛尔 28.5 1.3 86.0 3.8 90.9 4.7 75.1 12.1 多虑平 29.0 1.6 91.1 5.2 97.5 2.3 86.0 7.6 洛哌丁胺 27.9 1.0 97.2 2.4 96.5 3.0 90.0 6.1 QC中等浓度 普萘洛尔 35.0 1.2 94.8 2.5 96.1 2.7 85.4 5.3 多虑平 96.4 3.1 102.8 1.4 94.5 2.1 洛哌丁胺 33.5 0.9 100.4 1.7 102.1 2.0 94.8 2.3 QC高浓度 普萘洛尔 32.3 1.0 86.0 3.8 93.9 2.8 83.1 5.6 多虑平 0.9 92.9 3.2 97.1 1.8 91.9 2.8 洛哌丁胺 30.6 0.8 96.8 3.6 94.6 2.1 92.0 3.6 QC总体平均值 普萘洛尔 31.9 8.6 91.5 5.5 93.6 4.0 81.2 9.3 多虑平 32.1 7.9 93.4 4.4 99.1 3.2 90.8 6.0 洛哌丁胺 30.7 7.8 98.1 3.1 97.7 4.0 92.3 4.5 基质效应和磷脂去除 分析代表了整个浓度范围的三个样品，每个样品重复分析6次，以确定蛋白沉淀法、Oasis MCX和Oasis PRiME MCX样品萃取方案的基质效应。使用如下公式计算基质效应： 存在基质时的峰面积是指在萃取之后加入分析物制得的萃取基质样品的峰面积。无基质时的峰面积是指溶于溶剂中的分析物的峰面积。 使用蛋白沉淀法时，观察到显著的基质效应；平均基质效应为-51.6%(在-47.8%~-54.5%范围内)，这表示存在严重的离子抑制。采用混合模式强阳离子交换固相萃取方案时，基质效应降低， Oasis MCX的平均基质效应为-17.2%(在-15.3%~-18.4%范围内)。采用Oasis PRiME MCX(4步方案)和Oasis PRiME MCX(3步方案)时，平均基质效应进一步降至10%以下， Oasis PRiME MCX(4步方案)的平均基质效应为-7.8%(在-5.6%~11.0%范围内)， Oasis PRiME MCX(3步方案)的平均基质效应为-6.9%(在-3.7%~-10.4%范围内)。 为了评估磷脂去除率，我们进行了母离子扫描实验，对四种萃取方案所得的血浆样品萃取物中m/z184离子的母离子进行监测。以磷脂含量最高的蛋白沉淀法萃取物为基准，对磷脂峰面积进行归一化处归。图2清楚地表明， Oasis PRiME MCX方案相较于蛋白沉淀法去除了多达98%的磷脂，同样与蛋白沉淀法相比较， Oasis MCX也成功去除了多达86%的磷脂。 图2.采用蛋白沉淀法、Oasis MCX、Oasis PRiME MCX(4步方案)和Oasis PRiME MCX(3步方案)得到的萃取血浆样品中磷脂浓度的柱形图。 结论 与蛋白沉淀法相比， Oasis PRiME MCX(3步)和Oasis PRiME MCX(4步)样品制备方案可去除98%的磷脂，而且结果重现性优异，所得萃取物更纯净(基质效应小于-10%)。这两种方案是对只能去除86.6%的磷脂的Oasis MCX方案的改进，但在精度和回收率上Oasis MCX与Oasis PRiME MCX方案相当，基质效应为-17.2%。 尽管蛋白沉淀法是一种低成本的样品制备方法，但该方法的基质效应显著，因此样品净化效率可能较差(回收率低、基质效应高)，进而会影响生物分析方法的稳定性。 使用uElution板配合精简的Oasis PRiME MCX方案所得的血浆萃取物无需蒸发和复溶即可直接进样分析，为分析人员提供了一个快速的工作流程。该方法采用SPE规格的装置和萃取方案，可使用自动化液体处理设备轻松实现自动化，从而改进实验室工作流程，消除人为操作错误并实现样品追踪功能。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters和The Science of What's Possible是沃特世公司的注册商标。Oasis、ACQUITY、UPLC、MassLynx和Xevo是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ( 参考文献 ) Mohammad MaHDI Moeina， Aziza El Beqqalib，Mohamed Abdel-Rehimb. Bioanalytical methoddevelopment and validation： Critical concepts andstrategies.J Chromatography B. 2017；1043：3-11. 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 成都：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺 使用Oasis PRiME MCX高效萃取血浆中的普萘洛尔、多虑平和洛哌丁胺 在本应用纪要中，我们使用四种样品萃取方案(蛋白沉淀法、Oasis MCX、Oasis PRiME MCX 3步方案和Oasis PRiME MCX 4步方案)对三种药物进行分析，比较了这四种方法的回收率和基质效应(包括磷脂去除率)。