血浆中儿茶酚胺及其代谢物检测方案(液质联用仪)

「应用纪要1WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要] 使用UPLC Xevo TQ-S IVD 系统快速、高灵敏度分析血浆中儿茶酚胺及其代谢物 李倩倩1，刘文婧1，禹松林² 1沃特世科技(上海)有限公司，?北京协和医院 前言 儿茶酚胺类化合物是肾上腺髓质分泌的激素，可以引起人或动物血压升高、心跳加快、血管紧张、代谢率提高、耗氧量增加等。儿茶茶胺(包括肾上上素E、去甲肾上腺素NE和多巴胺DA)及其代谢物(变肾上腺素MN、去甲变肾上腺素NMN和3-甲氧基酪胺3-MT)在血浆中的浓度变化与许多病理过程息息相关，含量超标会引发高血压与心肌梗塞，含量过低会导致低血压。临床上可以用于辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤等内分泌相关的疾病，这些疾病如果不能及时治疗，心血管疾病的发病率和死亡率很高。但是儿茶酚胺及其代谢物的极性较大、结构相近，而且在血浆中含量较低、干扰较大，传统的免疫法不能准确定量，必须采用先进的样品前处理方法和灵敏度更高、选择性更好的液相色谱串联质谱法进行定量分析。 本应用纪要使用Oasis WCX uElution 96孔固相萃取柱净化富集血浆中E、NE、DA、MN、NMN和3-MT，色谱分离用HSS PFP色谱柱(2.1x100 mm， 1.8 um)， 采用Waters UPLCI-Class Xevo TQ-SIVD超高灵敏度的三重四极杆质谱建立了血浆样品中儿茶酚胺及其其谢物的快速、简便、高灵敏度的定量分析方法。 液相： ACQUITY UPLCI-Class 质谱： Xevo TQ-S IVD 中文名称 英文名称 简称 分子式 分子量 内标形式 肾上腺素 Epinephrine E CHNO， 183.1 d6 去甲肾上腺素 Norepinephrine NE CHNO， 169.1 d6 多巴胺 Dopamine DA CHNO， 153.1 d4 变肾上腺素 Metanephrine MN CoHNO， 197.1 d3 去甲变肾上腺素 Normetanephrine NMN C，HNO 183.1 d3 3-甲氧基酪胺 3-Methoxytyramine 3-MT C，HNO， 167.1 d4 表1.待测化合物的信息。 UPLC条件 UPLC系统： Waters ACQUITY UPLC I-Class 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS PFP 色谱柱，2.1x100mm， 1.8 um 柱温： 35°C 流速： 0.4 mL/min 流动相A： 0.1%甲酸的水溶液 流动相B： 乙腈 进样体积： 10 pL 梯度： 见表3 时间 流速 B% 梯度 (min) (mL/min) A% 曲线 0 0.4 98 2 1 0.4 98 2 6 2.5 0.4 90 10 6 3 0.4 10 90 6 3.5 0.4 10 90 6 4 0.4 98 2 1 表3.UPLC的梯度条件。 质谱条件 MS系统： Xevo TQ-S IVD 电离模式： ESI+ 毛细管电压： 0.5kV 脱溶剂气温度： 600°℃ 脱溶剂气流量： 1100L/h 源温度： 150°C 采集： MRM分析(表4) 图1.儿茶酚胺及其代谢物的结构式。 中文名 型号 Waters货号 HSSPFP色谱柱 2.1x100 mm， 1.8 um 186005967 Oasis WCX SPE pElution plate， 2 mg 186002499 96孔样品接收板 (方孔) 2mL，50/pkg 186002482 96孔样品接收板 (圆孔) 700 pL，25/pkg 186005837 粘性封膜 100/pkg 186006336 96 well plate预切口盖垫 5/pkg 186006332 表2.实验中用到的沃特世耗材信息。 化合物 MRM (m/z) 锥孔能量(V) 碰撞能量(eV) E 166.1>135.1 46 16 166.1>57.1 16 E-IS 172.0>139.0 46 14 NE 152.0>107.1 40 18 152.0>79.0 22 NE-IS 158.1>111.2 40 18 DA 137.0>91.0 36 18 154.0>137.0 10 DA-IS 141.1>95.0 36 18 MN 180.0>148.1 36 16 180.0>120.2 18 MN-IS 183.0>151.0 36 16 NMN 166.1>134.1 46 16 166.1>106.1 20 NMN-IS 169.0>137.0 46 16 3-MT 151.1>119.1 46 14 151.1>91.0 18 3-MT-IS 155.0>95.0 46 18 表4.儿茶酚胺及其代谢物的标准品和内标在Xevo TQ-SIVD上的MRM参数。 储备液和标准曲线的配制 儿茶酚胺及其代谢物的标准品和内标购于IsoSciences，混标储备液的浓度为1 pg/mL溶于0.1%抗坏血酸的甲醇中。使用时分别配制不同浓度的混合溶液做标曲(从2pg/mL-2000pg/mL)。混合内标储备液为10 ng/mL的MN、NMN和3MT， 100 ng/mL的E、NE和DA溶于0.1%抗坏血酸的甲醇中。使用时将混合内标储备液用水直接稀释100倍即得到内标工作液。 混合血浆和质控样品的配置 因为正常人血浆中儿茶酚胺及其代谢物的浓度较低，如果确诊嗜铬细胞瘤等疾病会导致浓度增高数倍，所以本实验先混合一批正常人的血浆样品做为低浓度质控品(low QC)， 再通过标准添加法配制中浓度(medium QC)和高浓度(highQC)质控品。因为儿茶酚胺及其代谢物共6个化合物在血浆中的正常范围不一样，所以加标浓度也不一样，我们分别配制了加标5、20、100和1000 pg/mL浓度的质控品。每个待测物选择不同浓度的质控品考察加标回收率、批内和批间精密度。 样品预处理 取200uL血浆或标准品加200pL内标工作液，涡旋混匀1 min。 Oasis WCX pElution SPE流程 根据图2所示方案提取预处理后的标准品或血浆样品，洗脱液直接在SPE的正压装置上吹干大约10min后用40uL水复溶，然后在96孔板的恒温震荡仪上摇匀1 min后进LC-MS/MS分析。 图2. Oasis WCX uElution 96孔固相萃取柱富集纯化儿茶酚胺及其代谢物的SPE方案。 实验结果 标准品和实际血浆样品的分离色谱图 儿茶酚胺及其代谢物标准品用HSS PFP色谱柱分离、Xevo TQ-SIVD系统检测的代表性MRM色谱图见下图3(A)。可以看出儿茶酚胺及其代谢物在HSS PFP 色谱柱上达到了良好的分离，并且峰形对称、噪音很低。图3(B)是正常人血浆样品经Oasis WCX uElution SPE纯化富集后检测的色谱图，可以看出SPE处理后的样品几乎没有干扰，每个待测物都可以进行准确定量分析。 图3. (A) 100 pg/mL 的儿茶酚胺及其代谢物标准品、(B)正常人血浆样品经Oasis WCX pElution SPE纯化富集后检测的色谱图。 线性 分别配制2-2000 pg/mL的儿茶酚胺及其代谢物标准品的混合标样，加内标经样品预处理后过Oasis WCXSPE，进质谱分析，检测方法的线性(见图4)。分析物浓度和响应值(分析物峰面积/IS峰面积)之间呈线性，且线性相关系数r²>0.999，定量限和线性范围见表5。 图4.(A)E、(B)NE、(C)DA、(D)MN、(E)NMN、(F)3-MT在Xevo TQ-SIVD上的标准曲线，采用1/x加权线性拟合。 化合物 检测限 (pg/mL) 线性范围 (pg/mL) 线性方程 R2 MN 1 2-2000 Y=0.0144882X+0.00665962 0.9998 NMN 1 2-2000 Y=0.0153982X+0.00933652 0.9999 3-MT 1 2-2000 Y=0.00970358X+0.010779 0.9998 E 5 10-2000 Y=0.00371078X+0.000925516 0.9997 NE 10 20-2000 Y=0.00176567X+0.00196313 0.9994 DA 10 20-2000 Y=0.00547362X+0.0290133 0.9999 表5.儿茶酚胺及其代谢物在Xevo TQ-S上的检测限、线性范围和线性方程。 本实验通过标准添加法考察血浆样品的加标回收率。根据儿茶酚胺及其代谢物在人血浆中的正常浓度范围分别在混合血浆中添加低、中、高浓度的混合标准品。其中E、NE、DA、MN和NMN的低、中、高加标浓度分别为20、100和1000 pg/mL；3-MT因为在正常血浆中的浓度非常低，所以低、中、高加标浓度分别为5、20和100 pg/mL。实验时会同时处理混合血浆和加标5、20、100及1000 pg/mL的5个不同浓度样本，每个浓度点各处理5个样品，每个样品进样1针，根据5针定量结果的平均值分别计算加标回收率，见表6。 化合物 LOW Medium High 加标浓度 回收率% 加标浓度 回收率% 加标浓度 回收率% pg/mL pg/mL pg/mL MN 20 109.2 100 103.4 1000 99.7 NMN 20 106.4 100 101.8 1000 99.4 3-MT 5 95.8 20 105.0 100 99.6 E 20 109.7 100 99.3 1000 96.2 NE 20 103.5 100 91.1 1000 94.9 DA 20 96.4 100 99.9 1000 102.7 表6.儿茶酚胺及其代谢物在低、中、高浓度时的加标回收率。 批内和批间精密度 低、中、高浓度质控样品的配置方法见前面“混合血浆和质控样品的配制”。每个批次每个低、中、高浓度点各处理5个样品，每个样品进样1针，根据5针定量结果分别计算批内精密度。分别进行3个批次的样品分析，根据3个批次，每个批次每个浓度各5个点的定量结果计算批间精密度，见表7。 化合物 Low QC Medium QC High QC 平均值 批内 批间 平均值 批内 批间 平均值 批内 批间 pg/mL CV% CV% pg/mL CV% CV% pg/mL CV% CV% MN 15 1.3 7.9 121 1.9 4.8 1031 2.0 3.8 NMN 36 1.9 8.8 140 3.4 4.1 1030 1.9 4.3 3-MT 1.3 7.7 8.9 22 3.9 3.4 105 4.4 6.1 E 17 5.0 10 118 2.3 5.6 1000 1.9 4.8 NE 150 3.3 6.2 244 2.9 6.9 1110 2.2 6.9 DA 10 8.3 13 115 7.5 8.7 1044 4.1 3.2 表7.儿茶酚胺及其代谢物在低、中、高浓度的血浆质控样品中的批内和批间精密度。 基质效应考察 因为儿茶酚胺及其代谢物是内源性化合物，目前没有儿茶酚胺及其代谢物的空白血浆可以购买，而常用的替代基质牛血清蛋白中也能检测到儿茶酚胺代谢物，所以本方案采用的是溶剂标准曲线定量法。为了评估基质效应的影响，本研究评价了不同人血浆样本中儿茶酚胺及其代谢物的基质因子(n=6， 在SPE处理后的血浆基质中加入1ng/mL儿茶酚胺及其代谢物的标准品)。每个化合物的基质因子如图5(A)，可见E、DA、MN、NMN和3-MT的基质因子在0.54-1.2之间，其中NE的基质抑制最明显，基质因子为0.25-0.56。但是实验中每个儿茶酚胺及其代谢物都使用对应的同位素内标，可以通过均一化的基质因子计算(分析物和内标的响应比值)补偿这种基质抑制或基质增强，得到补偿后的基质因子为0.92-1.04，见图5(B)。 图5.(A)6个人血浆样本的基质因子；(B)通过内标补偿后的6个人血浆样本基质因子。 结论 本应用纪要使用 Waters UPLC I-Class Xevo TQ-SIVD结合Oasis WCX uElution SPE的样品前处理方法，建立了血浆样品中儿茶酚胺及其代谢物的高灵敏度定量检测方法。样品前处理操作简便、快速，每个样品色谱分离时间仅4 min， 每天可以完成200例以上的样本分析。本方案对儿茶酚胺及其代谢物的检测灵敏度较高，线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围，6个化合物的加标回收率在90%-110%之间，批内和批间精密度均<10%，保证了样品检测的准确性和稳定性，非常适合临床大批量样本的高通量快速检测。 致谢 感谢北京协和医院检验科邱玲主任和禹松林老师对本研究的支持和帮助。 仅供研究使用，请勿用于诊断。 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特世科技(上海)有限公司 ( 上 海：021- 6 156 2 666 ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 广州：020-28296555 ( Waters China Limited香港：852-29641800 ) Waters和The Science of What's Possible是沃特世公司的注册商标。所有其他的商标属于各自的所有者。 免费售后服务热线：800(400)820 2676Www.waters.com 使用UPLC Xevo TQ-S IVD系统快速、高灵敏度分析血浆中儿茶酚胺及其代谢物 前言本应用纪要使用Oasis WCX µElution 96孔固相萃取柱净化富集血浆中E、NE、DA、MN、NMN和3-MT，色谱分离用HSS PFP色谱柱(2.1 x 100 mm，1.8 µm)，采用Waters UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD超高灵敏度的三重四极杆质谱建立了血浆样品中儿茶酚胺及其代谢物的快速、简便、高灵敏度的定量分析方法。结论本应用纪要使用 Waters UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD结合Oasis WCX µElution SPE的样品前处理方法，建立了血浆样品中儿茶酚胺及其代谢物的高灵敏度定量检测方法。样品前处理操作简便、快速，每个样品色谱分离时间仅4 min，每天可以完成200例以上的样本分析。本方案对儿茶酚胺及其代谢物的检测灵敏度较高，线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围，6个化合物的加标回收率在90% - 110%之间，批内和批间精密度均<10%，保证了样品检测的准确性和稳定性，非常适合临床大批量样本的高通量快速检测。