采用Ostro 96孔样本制备板和单步骤萃取方法提高DBS萃取物的纯度

[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE， [应用纪要] ■ Waters 采用Ostro 96孔样品制备板轻松提高DBS萃取物的洁净程度 Jessalynn P. Wheaton， Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain 应用优势 ■使用更快的孔内分析方式，更简洁的单步提取法进行DBS提取 沃特世解决方案 XevoTQ-S MS系统 ACQUITY UPLCBEH C 柱 Ostrol" 96孔样品制备板 关键词 干血斑分析法 (DBS)在医药行业正变得愈发重要。动物实验所带来的经济及伦理道德方面的问题，以及在运输以及储存生物样品时所产生的高额费用问题，都使得DBS分析法成为一种颇具吸引力的选择。DBS分析法可取得较高的分析物回收率。然而，该技术在去除内源性干扰方面收效甚微。以残余磷脂(PLs) 为主的干扰物是生物分析中遇到的主要问题。而LC/MS/MS系统中PLs的蓄积，则是引发基质效应的主要原因。在所有其他问题之中，基质效应会以无可预测的方式影响质谱响应值，降低分析方法稳定性并增加其可变性。Ostro 96孔样品制备板则可消除99%以上的PLs残留。 Ostro 96孔板可通过使用96孔制备板的形式进一步简化DBS萃取流程，同时提取分析物、去除磷脂、过滤干血斑纸片。DBS样品可在孔内萃取并稀释直接进样到LC/MS/MS系统中。该创新方法能够显著降低样品制备时间，并在萃取转化、、干燥、复溶过程中避免潜在的分析物流失。在本应用纪要中，我们同时应用了传统方法和Ostro 96孔样品制备板方法，对含有利培酮、利培酮羟基化代谢物、9-0H利培酮及其内标氯氮平(图1)的全血样品进行了萃取。 图1.利培酮、9-0H利培酮和氯氮平的分子结构、分子量和pKa值。 实验部分 ACQUITY UPLC条件 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×50 mm， 1.7 pm流动相A： 0.1%NH OH 水溶液流动相B： 50/50 ACN/MeOH流速： 0.6mL/min 梯度： 时间梯度模式梯度线型(min))9 %B06 0 99.5699.56366 进样量： 40 pL 进样模式： 部分环进样 柱温： 35℃ 样品温度： 15℃ 强洗针液： 60：40ACN：IPA+2%HCOOH 弱洗针液： 95/5H，0/MeOH 沃特世Xevo TQ-S MS运行条件， ESI* 毛细管电压： 3.0 V 脱溶剂温度： 550℃ 锥孔气流速： 150L/Hr 脱溶剂气流速：1000L/Hr 碰撞池压力： 2.6×10(3)mbar MRM通道监测， ESI+参见表1 表1.利培酮、9-0H利培酮和氯氮平的MRM通道、碰撞能量和锥孔电压。 化合物名称 母离子 子离子 碰撞能量 (eV) 锥孔电压(V) 利培酮 411.1 190.9 28 46 9-0H培培酮 427.1 109.8 38 42 氯氮平 327.0 269.7 22 42 样品制备条件 将20uL的全血样品滴在未经处理的Whatman DMPK-C血卡上。样品随后在室温下干燥2小时。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm血斑，分别放置进传统型DBS萃取法所需的1.5mL离心管和Ostro96孔板孔中。传统萃取方法在1.5mL离心管中进行，使用了250uL含5%水的甲醇溶液，随后样品进行1分钟涡旋、1分钟3000g离心，并最终将萃取物转移至96孔板上。使用Ostro96孔板的萃取则采用单步孔内萃取法。在Ostro 96孔板中添加3mm干血斑(图2)。以250 pL含5%水的甲醇溶液作为萃取溶 图2.采用Ostro96孔板的干血斑萃取流程。 液，涡旋操作1分钟、真空操作5分钟。两种方法产生的洗脱液都用250uL的水进行稀释，然后进样到LC/MS/MS系统中。 结果与讨论 在正离子模式下进行MS分析。鉴于DBS萃取物的直接进样通常会导致极稀释的样品，我们采用Xevo TQ-S以显著提升系统的灵敏度。这同时也有助于直接进样，并避免了吹干、复溶过程中可能存在的问题。 针对每一种样品制备方法，我们都比较了磷脂残留量。为了达成这一目的，我们对单个试管萃取和使用Ostro PLR板孔内萃取的DBS进行了比对，对五种磷脂进行了量化。与传统型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高达99.9%(图3)，。为能直观展示残余磷脂，传统型DBS萃取法和使用Ostro的孔内DBS萃取法所产生的五种不同磷脂的总离子流(TIC)如图所示(图4)。当使用Ostro板时，磷脂残留量几乎可忽略不计，且无蓄积情况。而当使用传统型DBS法时，即便出于预防磷脂蓄积的目的，采用高比例有机溶剂进行了1分钟的清洗，磷脂残余量依旧显著，而且在整个过程中都有蓄积。 我们进行了半验证，计算QC样品浓度不足预期值的15%，满足法规标准。9-0H利培酮(图6)及其母化合物LLOQ在全血中都达到 0.05 ng/mL。标准曲线在3个以上数量级呈线性，全血中的线性范围从0.05ng/mL到50 ng/mL(图7)/。 图3.使用Ostro 96孔板孔内萃取法和传统试管萃取法生成的磷脂面积计数总和比对， n=4。两种方法的萃取溶液均为95/5甲醇/水。5种求和的磷脂母离子质量分别为496、522、704、758和806。 [应用纪要] 图4.传统型DBS萃取和使用Ostro板的DBS孔内萃取条件下，5中磷脂成分总离子流图 (TIC)。 图5.MRM通道758>184色谱图，用于展示在传统型DBS和使用Ostro板孔内DBS萃取方法下单个PL在连续进样后的累积情况。采用2分钟、25-99.5%B梯度，随后保持高有机溶剂1分钟以冲洗色谱柱。 图6.空白DBS和使用Ostro 96孔板萃取法后直接进样0.05ng/mL 9-0H利培酮DBS萃取物的色谱图。 名称 类型 标准浓度 Rt 面积 IS面积 响应值 浓度 %偏差 0_05direct inject 042011_001 标准品 0.05 1.53 945 37691 37691 0.05 4.0 0_1_direct_inject_042011_001 标准品 0.10 1.52 1146 37531 37531 0.10 -4.5 0_25_direct_inject_042011_001 标准品 0.25 1.53 1682 35798 35798 0.23 -9.3 0_5 direct _inject_042011_001 标准品 0.50 1.53 3392 40329 40329 0.52 4.5 1_direct_inject_042011_001 标准品 1.00 1.53 5114 39457 39457 0.88 -11.5 5direct inject_042011_001 标准品 5.00 1.52 28760 38637 38637 5.78 15.7 10 direct inject_042011_001 标准品 10.00 1.52 57317 42923 42923 10.49 4.9 25 direct _inject 042011_001 标准品 25.00 1.52 56098 51934 51934 23.80 -4.8 50_direct_inject_042011_001 标准品 50.00 1.52 289427 45519 45519 50.51 1.0 0_075_QC direct _inject_042011_001 QC 0.075 1.52 1467 51641 51641 0.08 4.8 0_75_QC_direct_inject_042011_001 QC 0.75 1.52 4473 44994 44994 0.64 -14.1 7_5QC direct_inject_042011_001 QC 7.50 1.52 48110 49944 49944 7.53 0.4 15_QC_direct_inject_042011_001 QC 15.00 1.52 96139 42200 42200 18.00 20.0 图7.9-0H利培酮全血样品典型校准曲线和QC样品，R2=0.991，1/x2加权。 结论 简便、单步的DBS样品制备方法 相较于传统的DBS萃取技术，去除残余磷脂含量高达99.9% 采用Xevo TQ-S质谱仪，获得高灵敏度 去除LC色谱柱中PLs的蓄积 [应用纪要] 北京分公司 北京市朝阳区铜牛国际大厦 光华路15号院2号楼9层 电话：010-52093866 传真：010-52932298 广州分公司 广州市荔湾区中山七路50号 西门口广场1707-08室 电话：020-28296555 传真：020-28296556 成都分公司 成都市新光华街7号 航天科技大厦1803室 电话：028-65545999 传真：028-65545998 沃特斯中国有限公司 香港新界沙田香港科学园 科技大道西2号生物资讯中心6楼608室 电话：852-29641800 传真：852-25496802 免费售后服务热线： 800(400)8202676 沃特世科技(上海)有限公司 上海市浦东新区金海路1000号金领之都13栋电话：021-61562666传真：021-61562777 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. www.waters.com Waters、 The Science of What’s Possible、ACQUITY UPLC、Xevo和Ostro是沃特世公司的商标。 O2011年沃特世公司。印制于中国2011年7月720004047ZH KK-PDF 采用Ostro 样品制备板轻松提高DBS萃取物的洁净程度