尿样中氧化苦参碱检测方案(毛细管电泳仪)

色 谱Chinese Journal of Chrom atography2007年9月Sep tem ber 2007Vol 25No. 5694~698 第5期·695·王 星，等：毛细管电泳中移动反应界面法富集和检测尿样中的氧化苦参碱 毛细管电泳中移动反应界面法富集和检测尿样中的氧化苦参碱 王 星. 张 薇. 樊柳荫. 曹成喜 (上海交通大学生命科学技术学院生物分离与分析实验室，上海200240) 摘要：采用建立在移动反应界面理论上的体系进行尿样中氧化苦参碱的富集与定量检测。与传统的毛细管电泳相比，体系中引入了富集缓冲溶液(富集相)和分离缓冲溶液(分离相)。优化的条件如下：样品缓冲溶液为20mmol/L甲酸钠(用氨水调节pH至10.70)，富集缓冲溶液为40mm ol/L甲酸甲酸钠(pH2.60)，分离缓冲溶液为100 mm ol/L 甲酸甲酸钠(pH4.80)；样品相压力进样1.4 kPa X3 m in，富集相压力进样1.4 kPa X7 m in，紫外检测波长210 nm，电压21 kV。氧化苦参碱在2.2~65mg/L的质量浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.9991)，检出限为 0.74mg/L，灵敏度比常规毛细管电泳方法提高约70倍，重现性良好。该方法已经成功地应用于尿样中氧化苦参碱的检测。 关键词：毛细管电泳；移动反应界面；氧化苦参碱；富集；尿样 中图分类号：0658 文献标识码：A 文章编号：1000-8713(2007) 05-0694-05 栏目类别：研究论文 D ete rm ination ofOxym atrine in Urine S am p les byCap illary E lectrophores is w ith S tack ing Inducedby M oving Reaction B oundary WANG Xing， ZHANG Wei， FAN Liuyin， CAO Chengxi (L abora tory of Ana lyticalB iochem istry & B io-Separation， School of L ife Science and B iotechn ology，Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China) Abstract： A stack ing systembased on moving reaction boundary (MRB) for stacking andquantitative dete mm ination of oxymatrine (OMT) in urine sam ples was developed. The experi-m ental conditions were op tm ized for the stacking ofOM T as w ell as its separation.The optim ized conditions were 20 mm o1/L HCOONa (pH 10.70 adjusted by w eak alkali of ammoniarather than strong alkali of sodium hydroxide) as sample buffer， 40 mm ol/L HCOOH-HCOONa(pH 2.60) as stack ing buffer， 100 mm ol/L HCOOH-HCOONa(pH 4.80) as separation buffer，1.4 kPa (3 m in) sample phase injection and 1.4 kPa (7 m in) stack ing phase injection， 210 nmof de tec tion w avelength， 21 kV of voltage. The linear response ofOMT concentration rangedfrom 2.2 to 65 m g/L w ith high correlation coefficient (r=0.9991)，the lim it of de tection(LOD) for OMT w as 0. 74 mg/L， and sensitivity w as enhanced by 70 tim es. This m ethod canbe w ell used for quantification ofOMT in urine sam p les w ith high sens itivity and can be furtherapp lied in the investigation of pha mm acokinetics. Key words： cap illary electrophoresis (CE)； moving reaction boundary； oxym atrine； stack ing；urine 氧化苦参碱(OMT)是苦参根部主要的醌类生物碱。虽然对人畜有害，但是具有很强的药用价值。目前氧化苦参碱已被广泛地用于病毒性肝炎、癌症、心脏病和皮肤病的治疗[2.3]o 目前，用于检测氧化苦参碱的方法主要有高效液相色谱法「4.5]、高效毛细管电泳法6]以及液相色 谱质谱联用法.[1等。液相色谱法因为需要大量的预处理步骤而稍显繁琐。与其相比，毛细管电泳具有速度快、分离效率高、上样量小等优点。但是，因为毛细管的光路只有50~100um，所以紫外吸收检测法的灵敏度不高。最近，随着众多富集方法的出现，毛细管电泳的灵敏度大大提高，使得这一方法的 ( 收稿日期：2007-03-29 ) ( 第一作者：王 星，女，硕士， E m a i l： s hi r ley . w angx ing@ gm ail com. ) ( 通讯联系人：曹成喜，男，教授，Tel： (021) 3 4 205820，Email： cxcao@sjtu. edu. cn. ) ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 20475036). ) 应用范围更为广泛[8-30]。这些富集方法包括：场放大样品富集(FASS)9场放大上样(FASI)1101、pH梯度111，121、pH动态连接.[13，14]，以及等速电泳法15-17]和 sweeping (推扫)富集法[18-20] 移动反应界面法(MRB)[23，24]是建立在沉淀反应界面理论、[21，22]和移动界面理论[23]基础上的一种富集方法。一系列关于移动沉淀反应界面反26.27]及中和界面[28-301的实验定量地证明并发展了这一理论。在MRB方法中，背景缓冲溶液和样品缓冲溶液间形成反应界面(见图1)，样品在界面处实现富集。这一富集方法的关键是物质的移动速度大于界面的移动速度，从而达到富集效果。这一关键条件已被许多定量实验证明T31，32] 图1基于移动反应界面的操作步骤 Fig 11Operation steps by developed MRB m ethod a.injection of sample buffer， stacking buffer in order； b.app lication ofvoltage， the MRB was created； c. OMT and SRD(IS) were com pletely focused； d. separation ofOMT and SRDafter stacking MRB理论已经被进一步用于富集两性物质133，34]和巴比妥类物质1351，但这一方法尚未用于碱性物质的富集。本文应用MRB的方法进行氧化苦参碱的富集及进一步的定量检测。 1 实验部分 1.1试剂与材料 氧化苦参碱和槐定碱(SRD，纯度>99%)购自中国药品生物制品检定所。甲酸、甲酸钠、盐酸氨水(均为分析纯)和氢氧化钠(优级纯)均购自上海试剂公司。空白尿样取自健康成年人，储存于-20℃条件下。 1.2 仪器和条件 ACS 2000高效毛细管电泳仪(北京彩陆仪器公司)，紫外检测器(210nm)。两根毛细管(河北永年 光学仪器厂)分别为 52 cm X75 pm(有效长度43cm)和 73 cm X75um(有效长度64 cm)。运行温度22℃。样品缓冲溶液(样品相)为20mmol/L甲酸钠(用氨水调节 pH至10.70)，富集缓冲溶液(富集相)为40 mmol/L甲酸甲酸钠(pH2.60)，分离缓冲溶液(分离相)为100mmol/L甲骏甲酸钠(pH4.80)。毛细管使用前均依次用 1.0 mol/L的NaOH冲洗 20m in，超纯水冲洗 10 m in， 1.0 m o1/LHC1洗 20m in，分离缓冲溶液冲洗 30m in。 1.3 溶液的配制 将标准品固体溶容在超纯水中配成含0.65g/L氧化苦参碱、0.52g/L槐定碱的母液。系列浓度的各标准溶液用样品缓冲溶液稀释母液得到。分别配制一系列浓度和 pH值的甲酸甲酸钠溶液及甲酸钠溶液作为富集缓冲溶液、样品缓冲溶液及分离缓冲溶液。 1.4 样品配制 将氧化苦参碱标准溶液加入到空白尿样中得到系列浓度的样品溶液，再加入NaOH调节 pH至11.25。在500uL含有氧化苦参碱的尿样中加入50uL槐定碱(内标)标准溶液。再加入1000 uL 氯仿于10000r/m in 下离心 10m in。将水相移至另一容器中分别用500 uL氯仿再萃取两次。合并3次的有机相于50℃真空下干燥。剩余物用500pI样品缓冲溶液溶解。氧化苦参碱的终质量浓度分别为2.2，3.5，13，22， 44，65 mg/L. 2 结果与讨论 2.1 MRB基础上的富集与分离条件 OMT的pK 为7.72[361。根据 MRB 理论，富集相的 pH值必须低于OMT的pK3个单位，使OMT在这一相中具有最大的淌度；样品相的 pH值必须高于OMT的pK3个单位，使OMT在这一相中相对于电渗流处于静止状态，即电泳淌度为零。一旦施加电压，样品相和富集相之间形成化学反应界面。当界面速度大于电渗流速度时，OMT进入富集相，因其在这一相中具有较高的淌度，从而在界面富集。样品富集完成后可以实现分离。但是在本实验中，若使用低 pH的甲酸缓冲溶液，OMT和 SRD可以富集却无法分离；使用较高pH的甲酸缓冲溶液，OMT和 SRD 可以分离却无法富集。为了解决分离与富集的矛盾，在新的体系中，分别以20mmo1/L酸酸钠(用氨水调节 pH至10.70)为样品缓冲溶液，40mmol/L甲酸甲酸钠(pH2.60)为富集缓冲溶液，100mmol/L甲酸甲酸钠(pH4.80)为分离缓冲溶液。具体操作步骤如图1所示。首先用 分离缓冲溶液冲洗毛细管，然后依次采用重力上样方式(1.4kPa)注入样品相和富集相(见图11-a)。上样完毕，在毛细管两端插入装有分离缓冲溶液的电极槽，施加电压，移动反应界面在样品相和富集相的交界处形成(见图1-b)，OMT和 SRD在界面处富集(见图1-c)。富集完毕，两者可以在分离相中实现分离(见图1-d)。 22 富集和分离条件的优化 22.1 样品相优化 选择40mmol/L甲酸甲酸钠(pH2.60)作为富集相，研究以一系列浓度的甲酸钠作为样品相时对 OMT富集效果的影响。虽然当样品相为100mmol/L甲酸钠时峰高达到最大值，但是当其浓度从5 mm ol/L上升至160mmol/L时，出峰时间逐渐延长；当其浓度低于 20mm o1/L时，峰高随浓度的降 低而降低，出峰时间却基本保持不变。为了保证OMT和 SRD具有足够的时间进行快速分离，选择20mmol/L甲酸钠作为样品缓冲溶液。 在没有分离相存在的情况下，OMT和 SRD可以富集却无法分离(见图2-a)。将富集相和分离相结合以后，峰形并不理想(见图2-b)，槐定碱前部出现了扩散。根据MRB理论，样品相的 pH值必须远远高于OMT的pK值，使OMT的电泳淌度为零；肩峰出现的原因是因为样品相(20mmo1/L甲酸钠，pH8.48)的pH值偏低分别用NaOH和氨水调节样品相的 pH值，氨水比 NaOH对峰形的优化效果更好(见图2中的 c，d)。研究pH范围为9.23~10.92的用氨水调节的样品相，在 pH 10.70时 OMT和 SRD具有最好的峰形和富集效果。最终选择用氨水调节样品相的 pH至10.70. 222 分离相优化 只有富集相和样品相存在时，OMT和 SRD 可以富集但是无法基线分离(见图2-a)。因此我们引入分离相。当同时存在富集相和分离相时，对管长有一定的要求。因此选用总长73cm、有效长度64cm、内径75um的毛细管。 在毛细管电泳中，缓冲溶液的 pH值影响样品的解离度，因而对于OMT和 SRD 分离效果影响很大。本实验中，研究了40 mmol/L甲酸甲酸钠缓冲溶液在 pH 2.60~4.80范围内对分离效果的影响。结果显示，随着缓冲溶液 pH值的升高，OMT和 SRD的分离度也逐渐变大。为了维持缓冲体系缓冲容量的均一性，选择甲酸甲酸钠缓冲溶液的pH最高值4.80作为分离相的 pH值。 分离相的浓度也影响到富集和分离效果。根据实验结果，最终选择100 mmol/L甲酸甲酸钠(pH4.80)作为分离缓冲溶液，在这一浓度下OMT峰高响应可达到最大值。 2.2.3 上样时间和电压优化 为了达到更好的富集效果，样品相的进样时间由 2min 增加到3min，相应的富集相的进样时间也要延长。随着富集相上样时间的增加，OMT和SRD的迁移时间虽然延长了，但是峰高的响应值也有所增加。根据实验结果，最终选择的富集相上样时间为7m in。 研究操作电压范围为15~23 kV时对分离度、迁移时间和富集效果的影响。结果发现，电压对OMT和 SRD之间分离度的影响很小；在21kV时， 峰高达到最大值。考虑到分离速度和富集效率，选择操作电压为 21 kV。 2.3 富集效果 将最优化条件下的进样时间3min和常规区带电泳条件下的进样时间5s比比较，虽然在前者条件下OMT的浓度比后者低，但是其峰高响应值却比后者高。通过计算检出限，该富集方法可以使灵敏度提高70倍。 2.4 方法的专一性和可靠性参数 为了证明方法的专一性，从尿样中萃取 OMT，在不同的实验条件下进行分析。结果发现，OMT出峰后基线发生波动，有系统峰出现，估计是由于系统的复杂性引起的。但是实验证明基线波动总是发生在OMT出峰后，所以对于 OMT的定量检测没有影响(见图3)。 图3最优化条件下的方法专一性实验 Fig 3 Electropherogram s under op tim ized conditions a. blank sample of urine； b. 22 mg/L OMT and 17 mg/LSRD extracted from urine； c. 65 mg/L OM T and 52 mg/L SRDextrac ted from urine. O ther conditions are the sam e as in Fig2-d except 7 m in of stacking phase injection time. 在2.2~65 mg/L的质量浓度范围内，加标尿样中的氧化苦参碱呈良好的线性关系，相关系数达到0.9991。尿样中萃取出的氧化苦参碱的检出限(S/N=3)为0.74mg/L。 实验中参照标准曲线的测定方法，配制低、中、高3个浓度水平的样品溶液进行峰面积的日内相对标准偏差(RSD)和日间 RSD的检测。日内 RSD 为每隔2h检测一次，每个样品重复检测3次取平均值，一天检测6次。日间RSD为每天测量一次，每个样品重复检测3次，连续检测6天。从表1可见，无论是日内RSD还是日间 RSD 均低于5%，说明该方法具有良好的重现性。 表1 氧化苦参碱的日内 RSD和日间 RSD (n=6) Table 1 Intra- and in ter-day RSDs ofOMT(n=6) Concentration/ RSD/% (mg/L) intra-day inter-dav 2.2 4.0 2.7 13.0 1.2 29 43.3 2.4 3.0 为了检测方法的准确度，测定高、中、低3种浓度样品的回收率(见表2)，结果表明该方法具有良好的精确度。 表2氧化苦参碱的回收率(n=6) Table 2 Recovery ofOMT (n=6) Added/(mg/L) Recovery/% RSD/% 2.2 98.41 2.1 13.0 99.53 1.9 43.3 102.76 2.5 3 结论 本文提出了一种简单有效的富集和定量检测氧化苦参碱的方法。这一方法基于移动反应界面理论，具有很高的精密度、精确度和良好的线性关系，尤其是灵敏度高于常规毛细管电泳70倍。所以该方法可以用于痕量氧化苦参碱的检测，并可进一步应用到氧化苦参碱的药代动力学的研究中。 ( 参考文献： ) ( [1] P el l etier S W. A lkal o ids： Chem ical and B i o logical Perspec- tives ， Vol 2 . New York： Wiley， 1984：105 ) ( [2] M iao KL， Z hang J Z ， D ong Y， X iY F. 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Talan-ta， 2004， 63(2)： 4 91 ) 东曹株式会社在上海设立技术服务中心 2007年9月，作为日本东曹株式会社 (Tosoh Corporation)生命科学事业在门在中国的技术服务窗口，东曹达(上海)贸易有限公司技术服务中心宣布成立。在9月20日举行的开幕典礼上，来自中国科学院大连化学物理研究所的张玉奎院士、北京化工大学的付志峰副校长、东曹株式会社生命科学事业部门的内田裕行事业部长、东曹株式会社生命科学事业部门客户服务中心的中村瓦志主任及东曹达(上海)贸易有限公司的木内孝文总经理等分别发表了热情洋溢的致辞。开幕典礼后，来自国内科研院校的知名学者、大型制药企业的代表以及东曹株式会社在中国国内的代理商兴致勃勃地参观了技术服务中心的实验室。 东曹株式会社生命科学事业部门的产品包括： TSK-GEL高效液相色谱柱(包括反相、正相、分子尺寸排阻、离子、离子交换、疏水、亲和、手性柱等多种模式)；TSK-GEL高压层析分离纯化介质(离子交换、疏水模式)； TO YO PEARL 中低压层析分离纯化介质(包括分子尺寸排阻、离子交换、疏水、亲和等模式)； TO YOPE-ARL PAK、TO YOSCREEN层析工艺方法筛选用预装柱(包括分子尺寸排阻、离子交换、疏水、亲和等模式)；IC-2001型离子色谱仪；HLC-8320GPC EcoSEC凝胶渗透色谱仪； HLC-723GHbG8全自动糖血红蛋白分析仪；AIA全自动随机处理酶免疫分析系统；自动VMA /HVA分析仪； TRCRapid-160基因诊断系统等多种耗材及仪器。 2004年4月，东曹株式会社在上海设立了中国第一家全资子公司东曹达(上海)贸易有限公司。作为该公司主要部门之一的生命科学部门，从成立之日起便开始在各个领域积极拓展产品的国内市场。此次在上海成立的东曹达(上海)贸易有限公司技术服务中心更是顺应中国经济飞速发展以及东曹株式会社在华业务迅速扩展的又一重大举措。东曹达(上海)贸易有限公司技术服务中心的成立将加速东曹株式会社生命科学事业部门的产品在中国市场的推广，同时更将完善对中国国内客户的技术咨询与技术支持等服务。 ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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