人血浆中游离钙离子的含量检测方案(毛细管电泳仪)

第11期1555~1558分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry第36卷2008年11月 分析化学第36卷1556 毛细管电泳等离子体原子发射光谱测定人血浆中游离钙离子的含量 朱平川 徐祥书肖艳杨坤国邓必阳” (广西师范大学化学化工学院，药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，桂林 541004) 摘要毛细管电泳电感耦合等离子体原子发射光谱联用技术应用于人体血浆中钙元素的形态分析，对游离钙离子进行了定位表征与定量分析。在电泳缓冲溶液为30 mmol/L Tris-HC1(pH=7.4)及电泳电压为20 kV的条件下，得到人体血浆中钙的主要形态有8种，其中一种为游离钙离子，迁移时间的相对偏差小于2%(n=10)，血浆中游离钙离子的含量为 42.2 mg/L，该测定方法 RSD小于 5%。采用以上联用技术测得血浆样品中游离钙离子回收率为94.8%~104%；方法检出限为25p g/L。 关键词毛细管电泳，电感耦合等离子体原子发射光谱，血浆，钙，形态分析 1引言 钙是人体必需元素，也是生理活性元素，它在血液凝固、神经肌肉的传导过程中起着非常重要的作用，钙水平的高低直接影响到许多生理活动。元素的生物活性及毒性不仅与元素的总量有关，更主要的是与元素的赋存形态有关。不同的元素形态具有不同的化学和生物行为21。钙在血浆中有3种存在方式：蛋白结合钙、可扩散结合钙和游离钙离子。游离钙离子具有生物活性，在生命活动中具有极其重要的作用31。在游离钙离子测定方面，自 Ross等采用钙选择性电极测定生物样品中的 Ca*获得成功以来[4]，已迅速在临床化学、生物医学和环境保护中获得应用。More等率先用钙离子电极成功地测量了人体血清中 Ca*含量16。一些荧光指示剂(如 Fura-2和 Indo-1)也广泛应用于游离钙离子的测定。但是，这些方法都存在着一些多价离子的干扰131，荧光指示剂法还存在蛋白质的干扰，影响测量结果的准确性。近年来随着色谱技术的发展，色谱与光谱质谱联用技术在形态分析中的应用越来越广泛10~15]。毛细管电泳电感耦合等离子体原子发射光谱 (capillary electrophoresis inductively coup ledplasma atom ic em ission spectrometry， CE-ICP-AES)联用技术结合了 CE分离效率高和 CP-AES选择性好、检出限低及线性范围宽等优点，为复杂样品的元素形态分析提供了一种有力的分析手段I16]。本研究采用 CE-ICP-AES联用技术对人体血浆中的钙形态进行了分析，在优化的实验条件下，对人体血浆样品中游离钙离子进行了定位表征与定量分析。 2：实验部分 2. 1仪器与试剂 Optimna 2000DV 全谱直读电感耦合等离子体原子发射光谱仪(美国 PerkinEmer公司)；熔融硅石英毛细管(内径100p m、外径 375pm，河北永年锐沣色谱公司)；ACS2000高压电源北京彩陆科学仪器公司)；自组装毛细管电泳仪和毛细管电泳进样装置； CE-ICP接口参考文献[12]制作。该接口外观类似玻璃同心雾化器，雾化器中心管被毛细管所代替，它的外端口长约0.5cm，内径0.5mm。样品出口端为负极。 Ca *储备液(1g/L)，37%HC1(广州化学试剂二厂)；三(羟甲基)胺基甲烷(上海国药集团化学试齐有限公司)。肝素钠注射液(中国江苏万邦生化医药股份有限公司)，所用试剂均为分析纯，水为亚沸蒸馏水。毛细管电泳前所有溶液均经0.45m滤膜过滤。 ( 2008-03-19收稿；2008-06-30接受 ) ( 本文系国家自然科学基金(No. 20565001)、药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室基金 (No 0710900109)和广西科学基金 (No 0639029)资助项目 ) ( * Email： dengdy16@163. com ) 2. 2 ICP-AES和毛细管电泳工作条件 ICP-AES功率 1100W，载气 (Ar)流0.8L/m in，轴向观测。元素分析线 Ca 393. 366 nm，毛细管电泳分离条件：毛细管120 cm ×100umI D. ，电压 20 kV，压力进样 0.04MPa×10 s. 30 mmol/L Tris-HC1缓冲溶液 (pH7.4). 2.3样品处理及总钙含量测定 2.3.11血浆制备人血浆样品取自一一22岁的健康男子，空腹抽取静脉血5 mL注入内装抗凝剂肝素钠的离心管中，混合均匀后，以 4000 r/m in离心 10 min，取上层清液即为血浆。在4℃下保存备用。 2.3.2 血浆中钙的总含量测定 移取 0.50mL血浆于 25mL烧杯中，加入2.5 mL HNO，和1mL 30%的HOz，混匀，盖上表面皿，静置过夜后在电炉上微热至近干，冷却，加入1mL亚沸水和1mL浓 HCl， 微热至近沸，冷却后，定容于 50mL容量瓶中进行 ICP-AES测定。 2.4样品的引入 将过滤后的血浆样品利用超声波清洗器振荡 10 min，以除去气泡，防止电泳过程中出现电流断流现象。进样前用亚沸水和缓冲溶液分别冲洗毛细管5 m in，进样压力为 0.04MPa，进样时间为10s. 3结果与讨论 3. 1缓冲溶液对分离效率的影响 毛细管电泳分离效率取决于缓冲溶液类型、浓度及 pH值。在正常情况下，人体的血液pH为7.35~7.45之间，选择缓冲溶液 pH =7.4，得到 Ca形态不会因为 pH的不同而改变。固定pH =7.4不变，采用浓度为 10、20、30、40和 50 mmol/L Tris-HCl进行电泳分离，通过实验得知，使用 30 mmol/L分离效果最为明显。故本实验采用 30 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl作为电泳缓冲溶液。 3.22电泳电压对出峰时间和分离效率的影响 考察了电泳电压16~25 kV对分离效率及出峰时间的影响。随着电压的增加，迁移时间缩短，但是电泳电流也会随之增加，焦耳热效应明显。综合以上因素选择20 kV为电泳电压较合适，在此条件下，样品中8种 Ca的形态峰在 13min内能很好分离。 3.3人体血浆样品中钙的电泳形态分析 以 10 mmol/L Tris-HCI将血浆样品稀释10倍后，用0.45m滤膜过滤，对该滤液进行 CE-ICP-AES分析。从图1中可知 Ca在人体血浆中主要是以8种形态存在，分别用 Ca1~Ca8表示在图上。各形态的迁移时间如表1所示。 为了确定游离钙离子的形态峰位置，在相同血浆样品中加入 5 mg/L标准游离钙离子，在相同的电泳条件下进行电泳分离，电泳分离图见图2所示。对比图1和图2，得出8种形态峰的迁移时间基本一致，但是在图2中Ca2形态峰明显高于图1中的 Ca2，其立位置的形态峰强度变化不大。 从迁移时间来看，图1中Ca2的迁移时间为368s，标准溶液游离钙离子的迁移时间为365 s，而在图2中362 s处的 Ca2峰高明显增高，三者形态峰迁移时间非常吻合，依此可以判断 Ca2为游离钙离子。人体血浆中钙的其它形态峰的鉴定是一项艰难的工作，需要其它辅 图 1用 CE-ICP-AES分析人体血浆中 Ca的形态 Fig 1 Speciation of calcium in human plasma byCE-ICP-AES(1 10 diluted) separation conditions forthe plasma were described in Section 2 2 助手段和一系列标准物，但目前这些标准物质很有限，从某种程度上限制了这部分工作的深入开展。 3.4血浆中游离钙离子的测定及估算其它钙形态的含量 利用 CE-ICP-AES联用技术对人体血浆样品(稀释10倍后)中的 Ca进行了形态分析，从分离形态峰来看，血浆样品中 Ca主要以8种形态存在。由峰面积来计算游离钙离子及其它形态钙的含量(如表1所示)，并在最佳实验条件下，对血浆样品电泳测定10次，求得各种形态峰的迁移时间及峰面积的 表1血浆样品中钙的形态分析结果 Table 1 Analytical results of calcium speciation in human plasma 钙形态 迁移时间(s) RSD 浓度 (mg/L) RSD Calcium species Migration time (%) Concentration (%) Cal 237 1.5 3.B 2.5 Ca2 368 l. 4 42. 2 3. 0 Ca3 480 1.3 5.2 4. 1 Ca4 528 1. 5 15.4 3. 1 Ca5 594 6. 0 2.5 Ca6 616 6. 2 4.1 Ca7 706 3.5 Ca8 773 1.8 3. 9 由表1可知，人体血浆中游离钙离子的含量为42.2mg/L，利用 CE-ICP-AES测定血浆中钙的总量为90.3 mg/L，与 ICP-AES测量结果(钙的浓度为 94.8 mg/L) 图2人体血浆浆加入 5 mg/L标准游离钙离子后 Ca的形态 Fig2 Electropherogram of human plasma (110diluted) spiked with 5 mg/L free calcium (Ⅱ)Separation conditions for the plasma weredescribed in Section 2. 2 相比，为该含量的95.3%，其含量偏低的原因，与毛细管的吸附有关，也可能与有些钙形态含量太低，无法检出有关。 3.5检出限及加标回收实验 在相同实验条件下，对空白溶液(0.1mL肝素钠 +3.5 mL 10 mmol/L Tris-HC1)连续测定10次，用峰面积定量，以3倍的标准偏差所对应的含量计算出 Ca的检出限为 25p g/L。分别在4个血浆样品中加入5mg/L标准游离钙离子进行加标回收检测，其加标回收率为94.8%~104%；RSD 为28%~4.8%。由于 ICP-AES具有元素选择性检测，避免了人体血浆中其它金属离子对测定钙的光谱干扰，因此，本方法为人体体液中游离金属离子含量的测定提供了一种准确可靠的方法。 ( References ) ( 1 JiaLi贾 丽)， C hen Xi(陈 曦)， Wang Xiao-Ru(王小如)， Xu Mu-Sheng(徐木生)， Yang Peng-Yuan(杨芃原).Chinese Joumal of Chrom atography(色谱)，1998，1 6 (5)： 402~405 ) ( 2 Yin XueBo (尹学博)， He XiWen(何锡文)， Li Yan(李 妍)， Yan Xiu-Ping(严秀平). 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Chron atogr A，2000，891(1)：139~148 D eterm ination of Free Calc ium in Human Pasma byCap illary Electrophoresis-In ductively CoupledPlasma A tom ic Em ission Spectrom etry ZHU Ping-Chuan， XU Xiang-Shu， XAO Yan， YANG Kun-Guo， DENG Bi-Yang (Key L abora tory for the Chen istry and M olecu lar Engineering ofM edicinal Resources ofM in istry of Education of China，College of Chen istry and Chen ical Engineering， Guangxi N om al University， Guilin 541004) Abstract A new method was developed for the speciation analysis of calcium and detem ination of free calcium concentration in human plasma by on-line cap illary electrophoresis (CE) with inductively coup led plasmaatomic emission spectrometry (CP-AES). Baseline separation of calcium speciation was achieved by CE-ICP-AES under the conditions of separation voltage of 20 kV and running buffer of 30 mmol/L Tris-HC1 (pH=7.4). The fomm s of calcium in plasma has eight species One of them is free calcium. The relative standarddeviation (RSD， n=10) was 1. 3% to 1.8% for migration time Free calcium concentration in plasma was42. 2 mg/L. The recovery spiked with 5 mg/L free calcium was 94. 8% to 104%. The detection lim it was25pg/L. Keywords Cap illary electrophoresis， inductively coupled plasa-atomic emission spectrometry， humanplasma， calcium， speciation analysis ( (Received 1 9 March 2008； a c cep ted 30 June 2008) ) 中国化学会分析化学委员会关于申请分析化学基础研究梁树权奖"的通知 分析化学基础研究梁树权奖是以已故的我国著名分析化学家梁树权先生命名的分析化学领域的最高奖项。本奖项旨在鼓励我国中青年分析化学工作者献身于分析化学学科的基础研究和教育工作，培养优秀人才，促进和推动我国分析化学学科的发展。 本奖项为国内分析化学基础研究成果个人奖。凡年龄在55周岁以下，具备下列条件之一者均可申报参加评选：(1)分分析化学基础研究中确有创新，观点明确、数据完整、结论可靠，并已在国内外刊物上发表获得较高的引用；(2)在解决分析化学基础研究的某一技术难题方面有独创和革新，并经鉴定确认对国民经济建设有较大经济效益或社会效益；(3)在分析化学教学的理论和实践中有所改进和创新，并取得优异成绩。 本奖项为个人奖，凡属集体研究成果，申请人必须是该成果的实际主要完成者。申报内容需反映个人独立的实际贡献，并附本单位学术组织的证实材料。本奖项三年评选一次，每届两名，获奖名单报送中国化学会批准、备案。在当年的中国化学会分析化学学术年会颁奖。 中国化学会分析化学委员会将于2008年12月1日至2009年5月20日受理第五届分析化学基础研究梁树权奖"的申请。申请材料包括申请表、单位推荐书、成果技术资料(论文目录—包括题目、发表时间及刊物，10~15篇有代表性的论文及对所取得的成就的1000~2000字综述)，国内外的反映和引用期刊(最好附 SC检索)，获奖成果及成果推广和应用情况，社会或经济效益，以及有关证明材料。全部申请材料均需打印，一式五份。寄长春市人民大街5625号中国科学院长春应用化学研究所陈杭亭收(邮编130022)。材料概不退回，请自留底稿。 请登录本刊网站 http//： www. analchem.cn，获取申请表格。 中国化学会分析化学委员会 ( 2008年8月 ) O China Academic Journal Electronic Publishing House. 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