尿液中麻黄碱和可待因检测方案(毛细管电泳仪)

分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Joumnal of Analytical Chem istry第8期1137~1141第37卷2009年8月 分析化学第37卷1138 阳离子选择性耗尽进样胶束扫集法测定尿液中的麻黄碱和可待因 李斯光1，4 李 3海燕 蔡卓4 程昊 李利军*2 (广东科贸职业学院，广州510430) (广西工学院生物与化学工程系，柳州545006)’(中山大学中山医学院，广州510080) (广西大学化学与化学工程学院，南宁 530004) 摘 要 联用选择性耗尽进样和胶束扫集两种在线富集技术，建立了尿样中麻黄碱和可待因含量测定的灵敏方法，并通过日内、日间、柱间实验考察了方法的稳定性。胶束扫集电动色谱缓冲体系为80 mmol/L十二烷基磺酸钠(SDS)-20 mmol/L NaH， PO4 (pH 2.20)-18%乙腈(V/V)，分离电压-20kV，进样电压 10 kV，进样时间 150 s，测量波长200 mm。同时讨论了 pH值、SDS浓度、耗择性耗尽进样萃取液电导、进样电压、进样时间和进水长度等对分离效果的影响。结果显示，方法富集功能很强，对麻黄碱和可待因含的富集倍数分别达5800和2490以上。在优化条件下，方法线性关系良好(r=0.9999)，麻黄碱和可待因的线性范围分别为0.500~16.0g/L和2.00~48.0 ug/L，检出限分别为0.10和0.80 ug/L。方法稳定性良好，日内、日间和柱间的RSD分别为2.6%，5.9%和6.6%。应用于实际尿样分析，回收率在96.8%~106%之间，RSD≤4.7%，结果比较满意。 关键词 选择性耗尽进样，胶束扫集电动色谱，麻黄碱，可待因，人尿 引 言 针对毛细管电泳紫外检测器浓度灵敏度较差的问题，出现了多种新技术和新方法，包括应用高灵敏度检测器、改造检测池和在线富集技术等。其中在线富集技术无需增加设备或改造检测池，仅通过对缓冲液组成和进样程序进行调控就可显著提高灵敏度，颇受重视。在线富集技术大致可分为样品电场堆积、高盐堆积[2.3]胶束扫集14)和移动化学介面技术等，其中堆积技术往往在进样时实现，可与后两种技术联用16~8]，进一步改善灵敏度。本实验结合阳离子选择性耗尽进样(CSEI)和胶束扫集(Sweep-MEKC)两种在线富集技术，成功对尿液中的麻黄碱和可待因进行了测定9 可待因、麻黄碱等常用于止咳药，但这两种药物滥用容易引起药物依赖性，严重可导致服药者精神崩溃甚至作出极端行为。因而，尿液中这两种成分的含量测定对临床医学、药代动力学均具有重要意义，已报道的相关测量方法较多，主要有高效相色谱法[10，11]、气相色谱法12，13]毛细管电泳法14，15]和微乳液电动色谱法【16，17]1，但未见毛细管电泳在线富集法同时检测尿液中麻黄碱和可待因的报道。相比而言，CSEIsweep ing法具有灵敏度高、好择性好、样品用量少、样品处理简便、方法经济快速等优点。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆公司)，包括实验室自制电动进样器，未涂层熔融石英毛细管(62.0 cm X50 um， 40.0 cm)，检测波长 200 mm。UV-2102PC型紫外可见分光光度计(美国Unico公司)； SXZ-81光学显微镜(梧州光学仪器厂)；DL-60D超声青清洗器(上海之信公司)，分析天平(美国奥豪斯上海公司)；Mettler toldedo Delta 320型酸度计(瑞士梅特勒托利多公司)；DDS-11A电导率仪(上海雷磁公司)。 磷酸可待因、盐酸麻黄碱和盐酸曲马多对照品(中国药品生物制品检定所)；NaH， Po4， H Po4，HCl，乙腈、十二烷基磺酸钠(SDS)、乙酸乙酯均为分析纯。水为二次蒸馏水。 ( 2009-01-04收稿；2009-05-15接受 ) ( 本文系广西自然科学基金 (No. 0481019)和5广东科贸学院院学课题 (No GDKM2009-25)资助 ) ( * Em ail： lilijun0562@ sina c om ) 2.2 实验方法 配制盐酸麻黄碱、磷酸可待因和盐酸曲马多标准贮备液，浓度分别为416，400和492 mg/L，置于冰箱中4℃保保。pH值及电导率均使用85% H， PO调节。所有溶液进入毛细管前均用0.45 um 滤膜过滤，超声脱气。实验前依次用1mol/L NaOH溶液、水、萃取缓冲液分别冲洗 10 min. 选择性耗进样胶束扫集方法：先将毛细管充满萃取缓冲液，10 kV下进样150 s，迅速采用-20kV进行分离。两次进样间毛细管用萃取缓冲液冲洗5min。 日内实验：对同一标准品，每隔2h测定一次，连续测定5次，统计。日间实验：配制标准样品溶液，等分成5份，每天取一份测定3次，连续测定7 d，统计。柱间实验：截取等长毛细管柱3根(同批次，并在显微镜下对进样端进行修整)，使用同一标准样品，每根柱子测定3次，统计。 尿样采自服用磷酸可待俊口服液的病人。取100uL尿样，加入 5 uL 2.5 mol/L NaOH，再加入乙酸乙酯2.00 mL，旋涡振荡 10 m in， 3000 r/min离心 5 min，取乙酸乙酯层1100uL，加入 5uL 0.05 mol/LHC1，45℃下减压蒸干，残余物用月11000uL水溶解，得待测液。待测液稀再稀释12倍测定麻黄碱。 3 结果及讨论 3.1 胶束扫集缓冲体系、有机改性剂和 SDS浓度的选择 本实验利用低 pH抑制电渗流，采用磷酸盐体系，考察了体系的 pH值(2.00，2.20，2.40和2.60)、 800 有机改性剂的种类(乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇)及浓度(10%~25%，V/V)对麻黄碱、可待因和曲马多出峰情况的影响，最后选定缓冲体系为20 mmo1/L NaH， PO4◆(pH2.20)-18%乙腈(V/V)。考察了 SDS浓度为20，40，55060，80和100 mmol/L时3种样品的出峰情况，结果如图13所示，当 SDS浓度增加时，峰高增大，出峰时间缩短，这是 230001F由于当SDS浓度曾大时，被测物的保留因子增大，样品与胶束的作用增强，浓缩到更高的浓度，因而峰高增高，出峰5(时间略有缩短。但是 SDS浓度的增高会导致电流增大，使 20 40 60 80 100 120Csps/(mol/L)SDS形成的堆积区宽度增大，引起峰宽增大，峰高减小。本实验在 SDS浓度大于 80mmol/L时，出现峰高降低的现象，因而SDS的浓度选择为80 mmo1/L。 图1 SDS浓度对峰高的影响 Fig 1 Effect of sodiium dodecyl sulfate (SDS)concentration on peak height 3.2 胶束扫集分离电压 考察了负电压为16，18，20，22和24 kV时3种样品的出峰情况。结果显示，随电压升高，3种样品峰高呈降低 1. 麻黄碱(ephedrine)；2.可待因(codeine)；3.曲马多 (tramadol)。 趋势，但出峰速度增快。综合考虑峰高及出峰速度，分离电压选择为-20kV。 3.3 选择性耗尽进样萃取液电导考察 萃取液电导率是影响电堆积效果的主要因素。根据体系相近的原则，实验选择以不含 SDS的分离缓冲液为萃取液，并使用 H，PO进行调节，考察了电导为3.5(不含 SDS的分离缓冲液)，5.6，6.6(优化条件下分离缓冲液电导)，7.6和 8.6mS/cm时曲马多、麻黄碱和可待因的出峰情况。结果显示，在萃取液电导与电泳分离缓冲液电导一致时，出峰最高(如图2A所示)，这是样品及 SDS的电堆积行为和电泳电流共同作用的结果。实验最终选择 20 mmol/L NaH，PO4乙腈18%(电导 6.6mS/cm)为萃取液，此时电泳电流也较稳定。 3.4 选择性耗尽进样中进样电压、进水柱长度及进样时间的影响 考察了进样电压为8，10，12，14，16，18和20kV时的进样效果。结果表明，随进样电压的升高，进样效率增大，但峰宽有所展宽，进样时或随后的分离过程中出现断流的机率增大，为了保证较高的进样成功率，实验选用较低的进样电压 10 kV。 为考察水柱的影响，比较了进水时间为0，20，40， 60， 90， 120 s(H=16.0 cm)时的出峰情况。结果表明，对于使用正电源进样，进样时间长达数分钟，毛细管进样端经彬理修整的情况，进水长度对进样 效果的影响并不明显。考虑到简化操作有利于提高实验的稳定性，进样前不引进水柱。 考察了进样时间为60，120v150，180，210和240 s(U=10 kV)时的出峰情况，结果如图2B所示。随进样时间增长峰高呈增高趋势，但峰宽增大，柱效略有下降。当进样时间>180s时，样品量过载，峰严重展宽，甚至分峰。综合考虑峰高和峰形，进样时间设定为150s. 图2 萃取液电导(A)和进样时间(B)的影响 Fig 2 Effect of conductiveity of extraction buffer(A) and sample injection time(B)1.麻黄碱(ephedrine)；2.可待因 (codeine)；3. 曲马多(tramadol)。 3.5 方法富集能力和方法性能考察 文献较多采用相对法检验在线富集技术的富集能力，即以某种电泳条件下的峰面积、峰高或检出限为参考基准1181。但是不同的研究报道采用的基准往往不同，因此得到的富集倍数难以进行比较。为此，本实验设计了一种新方法：以加压推使单一样品经过检测窗口时产生的吸收峰为基准，再用选择性耗尽进样胶束扫集法的中样品的峰高与之比较，得到绝对富集倍数。结果得出，麻麻碱、可待因和曲马多的绝对富集倍数分别为5807，2491和10256.如图3所示。 图3 选择性耗尽进样胶束扫集法的富集能力 Fig 3 Sensitivity enhancement of cation selective injection (CSEI) -sweep ing A：样品的吸收峰(absoip tion response of sample)； B： CSEIsweep ing 电泳图 (electropherogram obtained byCSE I-sweeping).分离缓冲液(separation buffer) 80 mmol/L SDS， 20 mmol/L NaH，PO4(pH 2. 20)，18%ACN(V/V)；进样时间(injection time) 150 s(10 kV)； 分离电压(separation voltage)-20 kV.曲马多、麻黄碱、可待因的浓度 (concentration of tramadol， ephedrine and codeine)： A. 19.7，16. 6，32. 0 mg/L；B. 4.0， 8.0， 32.0 ug/L。1.麻黄碱(ephedrine)； 2. 可待因(codeine)； 3.曲马多 (tramadol)。 用系列标准溶液，在优化条件下，对选择性耗尽进样胶束扫集法的性能进行了考察，得到麻黄碱和可待因的标准曲线、线性范围、相关系数及检出限(见表1)。 表111麻黄碱和可待因的标准曲线、线性范围、相关系数及检出限 Table1 Linear range， linear regression equation and detection lim it of ephedrine and codeine 被测物 线性范围 线性方程 相关系数 检出限 Analyte L inear range(ug/L) Linear regression equation Correlation coefficient Detection limit (ug/L) 麻黄碱 Ephedrine 0.5~16.0 Y=0. 205X+0.024 0.9999 0.10 可待因 Codeine 2.0~48.0 Y=0. 0601X-0.00870 0.9999 0.80 3.6 选择性耗尽进样胶束扫集法稳定性实验 在优化条件下，标准品按2.2项进行日内、日间及柱间稳定性实验，统计结果见表2。可见使用内标物的选择性耗尽进样胶束扫集法稳定性良好，甚至更换毛细管对实验的重复性也无显著影响。 3.7 实际样品分析及回收实验 尿样羊释400倍后直接进样，进样定性分析，加标前后 CSEI-sweep ing 图谱见图4A和4B。可见尿样中含有麻黄碱和可待因。由于尿样含较多无机盐，直接电动进样定量分析存在干扰，因而，按样品处理项对样品进行萃取，适当稀释后测定，可待因和麻黄碱的电泳图谱见图4C。经计算，尿样中麻黄碱和可待因的含量分别为13.1和 2.02mg/L，RSD(n=3)分别为2.5%和 1.3%。 表2 日内、日间及柱间稳定性实验 Table 2RSD of intra-day， inter-day and inter-column by standard 日内实验 Intra-day (n=5) 日间实验 Inter-day (n=7) 柱间实验 Inter-column (n=3) 可待因 麻黄碱 可待因 麻黄碱 可待因 麻黄碱 Codeine Ephedrine Codeine Ephedrine Codeine Ephedrine 峰高 Peak heightRSD (%) 13.5 12.8 14.3 10.2 7.3 3.8 峰面积 Peak area RSD (%) 15.3 17.8 13.4 13.9 3.5 2.0 保留时间 Retention tme RSD (%) 0.3 0.2 1.4 1.5 2.3 2.4 相对面积 Relate area RSD (%) 2.6 1.0 5.9 1.0 2.0 6.6 图4实际尿样 CSEIsweeping图谱 Fig 4Electropherogram obtained by CSEIsweeping A.实际尿样(real sample)；B，C. 加标尿样(real sample spiked with standards)； D. C样经稀释(diluted samp le C)。电泳条件见图 3 (electrophoresis conditions are the same as in Fig 3)。1.麻黄碱(ephedrine)； 2. 可待因(codeine)；3.曲马多(tramadol)。 在优优条件下，进行回收实验，结果见表3。结果表明，选择性耗尽进样胶束扫集法可用于尿样中麻黄碱和可待因的含量测定。 表 3尿样中麻黄碱与可待因的回收率 Table 3Recoveries for ephedrine and codeine in urine sample 被加测物入量 检出量 回收率 RSD Spiked Found RecoveryAnalyte (%)(ug/L) (ug/mL) (%) 加入量 检出量被测物 回收率RSD Spiked Found RecoveryIngredient (%)(g/L) (ug/mL) (%) 12.8 13.1 103 麻黄碱9.56 10.1 106 4.7 Ephedrine 6. 38 6. 66 104 5.07 4.91 96.8可待因3.80 3.84 101 3.9 Codeine2.54 2.58 102 References ( Quirino J P， Terab e S J. Chromatogr A， 200 0 ，902(1)： 1 19~135 ) ( 2 Shihabiz K Elecm phoresi s ， 200 2 ， 23(11)：1612~1617 ) ( 3 LiHaiL ing(李海玲)， X u H uiBi(徐辉碧)， Ga o Zhong-Hong(高中洪). Chinese J. . A n A a n l al Chem. (分析化学)，2007， 35(8)： 1 087~1091 ) ( 4 Quirino JP ， Km J B， T erabe S J. Chrom atogr A，2002 ， 965 ： 357~373 ) ( 5 Kim J B ， O kamoto Y， Terabe S J. 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TThe sample was injected at 10 kV for 150 s， separated at - 20 kV， and detected at200 nm. Effects ofpH， SDS concentration， and condeuctivity of extraction buffer， injection voltage， injectiontme， water zone length on the separation were discussed The result showed that， sensitivity enhancement ofEp and Code were above 5800 and 2490 times by CSE I sweep ing During method validation， calibration p lotswere linear(r=0.9999) over a range of 0.5 - 48 ug/L， and the LODs were 0. 10 ug/L for Ep and0.80ug/L for Co. Under the op timum conditions， good stability was obtained with， RSD≤2.6% for intra"day(n=5)， RSD≤5.9% for inter-day(n=7)， and RSD≤ 6.6% for inter-column(n=3).).FFurthemmore.this method was successfully applied for the dectection of Ep and Code in human urine with the recoverities of96.8%-106%， and RSDs ≤4.7%. Keywords Cation-selective exhaustive injection， sweep ing micellar electrokinetic chromatography， ephed-rine， codeine， urine ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net