摘 要:采用扫集胶束毛细管电泳,建立了快速测定尿液中麻黄碱和可待因含量的方法,并通过日内、日间实验对方法的稳定性进行考察。讨论了pH值、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、分离电压、进样时间等因素的影响。建立了扫集胶束电动色谱的最佳实验条件,其中pH 2.2缓冲体系含80 mmol/L SDS,20mmol/LNaH2PO4,18%(体积分数)乙腈,分离电压-20 kV,测量波长200 nm。在优化条件下,麻黄碱和可待因均在7 min内出峰,方法检出限(mg/L)、线性范围(mg/L)、相关系数分别为麻黄碱0.173、0.693~11.1、0.9993,可待因0.333、1.33~16.0、0.9993,应用于实际样品测定,回收率为94%~108%,RSD不大于3.5%。峰面积日内RSD不大于6.3%(n=5),日间RSD不大于9.3%(n=5)。
关键词:扫集胶束电动色谱法; 麻黄碱; 可待因;
分析测试学报FENXICESHIXUEBAO (Joumal of InstrumentalAnalysis)第27卷第12期2008年12月Vol. 27 No.121359~1362 1360分析测试学报第27卷 尿液中麻黄碱与可待因的扫集胶束电动色谱法快速测定 李利军,李斯光,蔡 卓2,李丽娜2,程 昊 (1.广西工学院 生物与化学工程系,广西 柳州 545006;2.广西大学化学与化学工程学院,广西 南宁 530004) 摘 要:采用扫集胶束毛细管电泳,建立了快速测定尿液中麻黄碱和可待因含量的方法,并通过日内、日间实验对方法的稳定性进行考察。讨论了 pH值、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、分离电压、进样时间等因素的影响。建立了扫集胶束电动色谱的最佳实验条件,其中 pH 2.2缓冲体系含80 mmol/L SDS, 20 mmol/LNaH,PO4, 18%(体积分数)乙腈,分离电压-20kV,测量波长200mm。在优化条件下,麻黄碱和可待因均在 7min内出峰,方法检出限(mg/L)、线性范围(mg/L)、相关系数分别为麻黄碱0.173、0.693~11.1、0.9993,可待因0.333、1.33~16.0、0.9993,应用于实际样品测定,回收率为94%~108%,RSD不大于3.5%。峰面积日内RSD不大于 6.3%(n=5),日间RSD不大于9.3%(n=5)。 关键词:扫集胶束电动色谱法;麻黄碱;可待因 中图分类号:0657.8;R446.12 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2008)12-1359-04 Rap id Detemm ination of Ephedrine and Codeine in Human U rineby Sweep ing M icellar Electrokinetic Chromatography LILi jun , L I Siguang, CA I Zhuo, LILina, CHENG Hao (1. Department of B iological and Chem ical Engineering, GuangxiUniversity of Technology, Liuzhou 545006.China; 2. College of Chem istry and Chem ical Engineering, Guangxi University, Nanning:5530004, China) Abstract The sweep ing m icellar electrokinetic chromatography (Sweep ing-MEKC) method was de-veloped for the detemm ination of ephedrine (Ep) and codeine(Co) in human urine sample Stability ofthis method was evaluated by intra-day and inter-day expermentssThe effects ofpH,SDS concentration, separation voltage and injection time on the separation efficiency were discussed TThe optmalconditions were using pH 2. 2 20 mmol/L NaH,PO4 as buffer containing 80 mmol/L SDS, and 18%ACN (by volume), app lying separation voltage of -20 kV and reading at 200 nm. Under the optimalconditions, the separation of Ep and Co was finished in 7 m inn The LODs (mg/L), linearity(mg/L) and correlation coefficient were 0.173, 0.693-11.1 and 0.999 3 for Ep, 0.333,11.33-16.0and 0.999 3 for Co, respectivelyThe RSD s of peak areas were no more than 6.3% for intra-day (n=5) and 9.3% for inter-day(n=5).This method was successfully used in the detemm ination of Epand Co of human urine with recoveries of 94%-108%, and RSD of no more than 3.5%.Key words: sweep ing micellar electrokinetic chromatography (Sweeping-MEKC); ephedrine;CO"deine 毛细管电泳(CE)具有高效、快速、微量、多模式、经济、自动化及洁净等优点,在化学、生命科学、临床医学、药学等领域已得到广泛应用。可通过采用高灵敏度检测器(如激光诱导荧光)、改造检测池、使用在线富集等‘技术解决紫外检测器灵敏度较差的问题,其中在线富集技术无需增加或改造设备,经济、方便,颇受欢迎。扫集胶束法是由电动色谱发展而来的一种有效的富集模式,其利用反向迁移胶束在电场的作用下,扫过样品区带,捕集样品并使之富集,随后样品通过电动色谱达到分离。该技术简单地将样品溶解于水中,样品溶液电导小于背景缓冲液,可引起电堆积富集,进一步提 ( 收稿日期:2008-06-23;修回日期:2008-07-26 ) ( 基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自0481019) ) ( 第一作者:李利军(1979-),男,河北黄梅人,教授,博士, Tel : 0772-2685028, E-mail: lilijun05 6 2@ sina. com ) 高检测灵敏度3-4] 可待因、麻黄碱是夫人止咳露、联邦止咳露等多种止咳药的有效成分,但是滥用这2种药物会造成药物依赖性,严重的可导致用药者精神崩溃,做出极端行为。因而测定尿液中可待因、麻黄碱的含量对临床医学、药物代谢动力学均具有重要意义。目前已报道的测量可待因和麻黄碱的方法主要有高效液相色谱法法51、气相色谱-质谱法6]1、毛细管区带电泳法'’等。本文使用扫集胶束电动色谱法,对尿液中的麻黄碱、可待因进行测定,方法经济、快速、高效、灵敏度高,测定结果令人满意。 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司),未涂层熔融石英毛细管中50um×62.0 cm, 有效长度40.0 cm。检测波长200 nm。 UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 (Unico仪器公司); DL-60D超声波清洗器(上海之信仪器公司);分析天平(奥豪斯上海有限公司), Mettler toldedoDelta 320型酸度计(梅特托托利多公司)。 磷酸可待因、盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所);磷酸二氢钠、磷酸、乙腈;十二烷基硫酸钠(SDS),乙酸乙酯。以上所有试剂均为分析纯;水为双蒸水;联邦止咳露(市售)。 1.2 实验方法 分别准确称取盐酸麻黄碱10.4mg,磷酸可待因10.0mg,用甲醇配制成400、416mg/L的对照品储备液,置冰箱4℃保存。缓冲液均用 100 mmol/L NaH, PO4、200 mmol/L SDS储备液配制,用85%磷酸调节 pH值。所有溶液进入毛细管前均用0.45 um滤膜过滤,超声脱气。 毛细管清洗:实验前依次用NaOH(1 mol/L)、水、运行缓冲液分别冲洗 10min。 扫集胶束法:重力进样时间60s,高度16.0 cm(进样长度约1.5cm),迅速采用-20 kV电压进行分离。2次进样间毛细管用缓冲液冲洗 5min。日内实验:对同一标准品,每隔2h测定1次,连续测定5次。日间实验:配制标准样品溶液,等分成5份,每天取1份测定,连续测定5天。 样品采集及处理方法。尿样取自一服用联邦止咳露的病人。尿样萃取:取200uL尿样,加入20uLNaoH (2.5mol/L), 再加入乙酸乙酯 2.00mL,旋涡振荡10 min, 离心5m in (3 000 r/min), 取乙酸乙酯层,加入10 uL盐酸(0.05 mol/L), 30℃下减压蒸干,残余物用200uL水溶解,得待测液。测定麻黄碱时,待测液再稀释6倍。 2 结果与讨论 2.1 扫集胶束电动色谱缓冲体系与有机改性剂的选择 本实验利用低 pH值抑制电渗流。在相应的 pH值下,考察了磷酸盐(pH=2.2)、丁二酸(pH=3.0)、酒石酸(pH=2.5)、乙二酸(pH=2.1)等缓冲体系。结果表明,在分离麻黄碱、可待因时,只有磷酸盐缓冲体系无杂峰、出峰稳定、峰形理想、基线平稳,所以选用磷酸盐体系。 考察了乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇及乙酰胺等有机改性剂对分离效果的影响,结果表明,5种有机改性剂均不同程度地改善峰形及分离度,但出峰时间延长,其中乙乙出峰峰形最好,分离度理想,出峰最快,故选乙腈作有机改性剂。考察了乙腈体积分数分别为10%、15%、18%、20%、25%时 ,对分离效果的影响。结果表明,随着乙腈体积分数的增加,2种样品分离度增大,但保留时间延长,当乙腈体积分数为18%时,分离度、峰形均理想,出峰快,因而选定18%乙腈。 在 pH为 2.0、2.2、2.4、2.6时,不经冲洗毛细管柱,连续3次进样考察麻黄碱、可待因的出峰情况。结果表明, pH对2种物质的分离度影响不大,但对峰高及峰形稳定性有一定影响,在 pH=2.2时,峰形的稳定性最好,随着 pH偏离2.2,峰形稳定性变差,因而选择缓冲体系的 pH为2.2,使其与磷酸的 pK 接近。在 pH=2.2时,考察了 NaH, PO浓度为0、10、20、30、40 mmol/L时的出峰情况,结果表明,NaH,PO4浓度增大时,样品的分离度小幅增大,出峰时间稍微延长,电流增大。NaH, PO4浓度为20 mmol/L时,2种样品具有足够的分离度,峰形稳定,保留时间短,电泳电流适中,因而选定 NaH, PO4的浓度为 20mmol/L。 2.2 SDS浓度的选择 考察了 SDS浓度为20、40、60、80、100 mmol/L时可待因、麻黄碱的出峰情况,结果表明,当SDS浓度增加时,峰高增大,出峰时间缩短。这可由 k=K(VIV)解释,其中k是保留因子,K是分配系数,V为胶束的体积,V为溶剂体积。可见 SDS浓度增大,k值增大,样品与胶束的作用越强,样品可浓缩到更高的浓度,因而峰高增大,且出峰时间缩短。但是 SDS浓度的增高会使 SDS在低导带中宽度增大,从而引起峰宽增大。本实验在 SDS大于80 mmol/L时,出现峰宽增大,峰高降低的现象,因而选择 SDS的浓度为 80 mmol/L。 2.3 分离电压、进样时间的选择 试验了电压为16、18、20、22、24kV时峰高及出峰时间的情况,结果显示,随电压升高,可待因和麻黄碱的峰高呈降低趋势,但出峰时间缩短。综合考虑峰高及出峰速度,选择 20 kV为分离电压。考察了扫集胶束法中进样时间为20、40、60、80、100s时,样品的出峰情况,结果表明,随着进样时间的延长,峰高呈增高趋势,但峰宽变大,柱效下降,当进样时间超过60s时,峰形稳定性下降,因而选择进样时间为60 s。 2.4 方法性能 在优化条件下,用系列标准溶液对方法的性能进行考察,结果见表1.I。可见,在一定范围内拟合曲线呈良好的线性关系。以标准品检验方法的检出限,根据信噪比(S/N)等于3,麻闲碱和可待因的检出限分别为0.173和0.333mg/L。以样品峰高为考察指标,经计算,扫集胶束电动色谱法对麻黄碱和可待因的富集倍数分别为6.5和4.5. 表1 扫集胶束方法的线性范围、回归方程、重复性及检出限 Table 1 Linearity,regression equation,rep roducibility of peak area,,aand LODs by sweep ing method |Sample Linear range o/(mg·L-l) Regression equation RSD(n=5)s./% LOD(n=3)p/(mg·L-1) Ephedrine(麻黄碱) 0.693~11.1 y=196x - 0.842 0. 999 3 4.3 0.173 Codeine(可待因) 1.33~16.0 y=69.3x+14.9 0.9993 2.6 0.333 2.5重重复性实验 在优化条件下,按照“1.2”方法进行日内、日间实验,统计结果见表2。可见扫集胶束法稳定性较好。 表2日内、日间相对标准偏差 Table 22 RSD of intra-day, inter-day by standard Sample RSD s./% Peak height Peak area Retention time Intra-day(n=5) Ephedrine(麻黄碱) 4.3 5.5 1.6 Codeine(可待因) 4.3 6.3 1.5 Inter-day(n=5) Ephedrine(麻黄碱) 6.3 7.2 3.2 Codeine(可待因) 3.4 9.3 3.1 2.6 实际样品分析及回收实验 将尿样按“1.2"项处理后,在优化条件下平行测定3次,电泳图谱如图1A-C所示,其中(Ⅰ)为测量可待因,(Ⅱ)为稀释6倍测量麻黄碱的情况。经计算,尿样中被测物的质量浓度(mg/L)及 RSD分别为:盐酸麻黄碱 14.8,3.9%;磷酸可待因1.87,1.3%。相比于文献「5],病人尿液中麻黄碱和可待因的质量浓度较高。 向尿样中添加一定量的标准品,按“1.2"处理后,在优化条件下,进行回收率实验,结果见表3.可见用扫集胶束法测定尿液中的麻黄碱和可待因,结果准确。 图 1 尿样色谱图 Fig.1 Electropherograms of urine sample (A) urine samp le without extraction(未萃取尿样),(B-I) blank urine sample(空白尿样),(B-Il) blank urine sample spiked with standard (空白尿样加标),(C) real sample(实测样品); buffer: 20 mmol/L NaH, PO4 (pH=2.2); SDS: 80 mmol/L; acetonitrile: 18%(by volume);separation voltage:-20 kV; sample injection time: 60 s; height: 16.0 cm; 1. ephedrine(麻黄碱), 2. codeine(可待因) 表 33尿样中2种被测物的回收率 Table 3 Recoveries of two analytes in urine sample Ingredient Added p/(mg·L) Found pr /(mg·L-) Recovery R/% Average recovery R/% RSD s./% Ephedrine(麻黄碱) 5.20 5.30 102 97 3.5 10.4 9.91 95 15.6 14.6 94 Codeine(可待因) 2.00 1.91 96 103 3.1 4.00 4.20 105 6.00 6.45 108 ( 参考文献: ) ( 陈义.毛细管电泳技术及其应用[M].北京:化学工业出版社,2000: 5-7. ) ( 孟品佳.毛细管电泳在线样品富集技术及在法庭科学中的应用[J].中国人民公安大学学报:自然科学版,2006, 12(2) : 1-8. ) ( [3] QURNOJP,KMJB, T ERABE S Sweep ing. conce n tration mecha n ism and applica t ions to high-s e nsitivity analysis in cap illary electrophoresis[ J ] . J Chromatogr. A , 200 2 ,965:357-37 3 . ) ( 41 QURNOJP, TERABE S Exceeding 5000 - fo l d concentration of dilute analytes in the micellar el e ctrokinetic chroma-tography[J ] . S cience, 1998, :282:465-468. ) ( 刘庆艳,张朝辉,陈波,等.人尿液中麻麻碱和可待因的液-液-液微萃取高效液相色谱法测定[J].分析测试 学报,2 0 08,27(1):26-29 ) ( 吴筠,崔凯荣.用GC-MS法测定尿中可待因及其代谢物的浓度[J].分析测试学报,1994, , 13(3) : 71-74 ) ( 饶毅,王义明,罗国安.毛细管区带电泳法测定复方磷酸可待因溶液有效成份[J].分析科学学报,2001,17 (3): 1 82-185. ) ( 更正声明 ) ( 在本刊2008年增刊 (P145)中,耿岳等作者的论文题目现现印刷错误,实为 倍硫磷原药中杂质的质谱定性分析”,作者简介栏的 "第一作者”介绍应删去。本编辑部对于由此给作者及读者造成的 不便深表歉意。 ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
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北京华阳利民仪器有限公司为您提供《尿液中麻黄碱与可待因检测方案(毛细管电泳仪)》,该方案主要用于尿液中麻黄碱与可待因检测,参考标准--,《尿液中麻黄碱与可待因检测方案(毛细管电泳仪)》用到的仪器有高效毛细管电泳仪(紫外检测)CL1030