尿液中麻黄碱与可待因检测方案(毛细管电泳仪)

分析测试学报FENXICESHIXUEBAO (Joumal of InstrumentalAnalysis)第27卷第12期2008年12月Vol. 27 No.121359~1362 1360分析测试学报第27卷 尿液中麻黄碱与可待因的扫集胶束电动色谱法快速测定 李利军，李斯光，蔡 卓2，李丽娜2，程 昊 (1.广西工学院 生物与化学工程系，广西 柳州 545006；2.广西大学化学与化学工程学院，广西 南宁 530004) 摘 要：采用扫集胶束毛细管电泳，建立了快速测定尿液中麻黄碱和可待因含量的方法，并通过日内、日间实验对方法的稳定性进行考察。讨论了 pH值、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、分离电压、进样时间等因素的影响。建立了扫集胶束电动色谱的最佳实验条件，其中 pH 2.2缓冲体系含80 mmol/L SDS， 20 mmol/LNaH，PO4， 18%(体积分数)乙腈，分离电压-20kV，测量波长200mm。在优化条件下，麻黄碱和可待因均在 7min内出峰，方法检出限(mg/L)、线性范围(mg/L)、相关系数分别为麻黄碱0.173、0.693~11.1、0.9993，可待因0.333、1.33~16.0、0.9993，应用于实际样品测定，回收率为94%~108%，RSD不大于3.5%。峰面积日内RSD不大于 6.3%(n=5)，日间RSD不大于9.3%(n=5)。 关键词：扫集胶束电动色谱法；麻黄碱；可待因 中图分类号：0657.8；R446.12 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2008)12-1359-04 Rap id Detemm ination of Ephedrine and Codeine in Human U rineby Sweep ing M icellar Electrokinetic Chromatography LILi jun ， L I Siguang， CA I Zhuo， LILina， CHENG Hao (1. Department of B iological and Chem ical Engineering， GuangxiUniversity of Technology， Liuzhou 545006.China； 2. College of Chem istry and Chem ical Engineering， Guangxi University， Nanning：5530004， China) Abstract The sweep ing m icellar electrokinetic chromatography (Sweep ing-MEKC) method was de-veloped for the detemm ination of ephedrine (Ep) and codeine(Co) in human urine sample Stability ofthis method was evaluated by intra-day and inter-day expermentssThe effects ofpH，SDS concentration， separation voltage and injection time on the separation efficiency were discussed TThe optmalconditions were using pH 2. 2 20 mmol/L NaH，PO4 as buffer containing 80 mmol/L SDS， and 18%ACN (by volume)， app lying separation voltage of -20 kV and reading at 200 nm. Under the optimalconditions， the separation of Ep and Co was finished in 7 m inn The LODs (mg/L)， linearity(mg/L) and correlation coefficient were 0.173， 0.693-11.1 and 0.999 3 for Ep， 0.333，11.33-16.0and 0.999 3 for Co， respectivelyThe RSD s of peak areas were no more than 6.3% for intra-day (n=5) and 9.3% for inter-day(n=5).This method was successfully used in the detemm ination of Epand Co of human urine with recoveries of 94%-108%， and RSD of no more than 3.5%.Key words： sweep ing micellar electrokinetic chromatography (Sweeping-MEKC)； ephedrine；CO"deine 毛细管电泳(CE)具有高效、快速、微量、多模式、经济、自动化及洁净等优点，在化学、生命科学、临床医学、药学等领域已得到广泛应用。可通过采用高灵敏度检测器(如激光诱导荧光)、改造检测池、使用在线富集等‘技术解决紫外检测器灵敏度较差的问题，其中在线富集技术无需增加或改造设备，经济、方便，颇受欢迎。扫集胶束法是由电动色谱发展而来的一种有效的富集模式，其利用反向迁移胶束在电场的作用下，扫过样品区带，捕集样品并使之富集，随后样品通过电动色谱达到分离。该技术简单地将样品溶解于水中，样品溶液电导小于背景缓冲液，可引起电堆积富集，进一步提 ( 收稿日期：2008-06-23；修回日期：2008-07-26 ) ( 基金项目：广西自然科学基金资助项目(桂科自0481019) ) ( 第一作者：李利军(1979-)，男，河北黄梅人，教授，博士， Tel ： 0772-2685028， E-mail： lilijun05 6 2@ sina. com ) 高检测灵敏度3-4] 可待因、麻黄碱是夫人止咳露、联邦止咳露等多种止咳药的有效成分，但是滥用这2种药物会造成药物依赖性，严重的可导致用药者精神崩溃，做出极端行为。因而测定尿液中可待因、麻黄碱的含量对临床医学、药物代谢动力学均具有重要意义。目前已报道的测量可待因和麻黄碱的方法主要有高效液相色谱法法51、气相色谱-质谱法6]1、毛细管区带电泳法'’等。本文使用扫集胶束电动色谱法，对尿液中的麻黄碱、可待因进行测定，方法经济、快速、高效、灵敏度高，测定结果令人满意。 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司)，未涂层熔融石英毛细管中50um×62.0 cm， 有效长度40.0 cm。检测波长200 nm。 UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 (Unico仪器公司)； DL-60D超声波清洗器(上海之信仪器公司)；分析天平(奥豪斯上海有限公司)， Mettler toldedoDelta 320型酸度计(梅特托托利多公司)。 磷酸可待因、盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所)；磷酸二氢钠、磷酸、乙腈；十二烷基硫酸钠(SDS)，乙酸乙酯。以上所有试剂均为分析纯；水为双蒸水；联邦止咳露(市售)。 1.2 实验方法 分别准确称取盐酸麻黄碱10.4mg，磷酸可待因10.0mg，用甲醇配制成400、416mg/L的对照品储备液，置冰箱4℃保存。缓冲液均用 100 mmol/L NaH， PO4、200 mmol/L SDS储备液配制，用85%磷酸调节 pH值。所有溶液进入毛细管前均用0.45 um滤膜过滤，超声脱气。 毛细管清洗：实验前依次用NaOH(1 mol/L)、水、运行缓冲液分别冲洗 10min。 扫集胶束法：重力进样时间60s，高度16.0 cm(进样长度约1.5cm)，迅速采用-20 kV电压进行分离。2次进样间毛细管用缓冲液冲洗 5min。日内实验：对同一标准品，每隔2h测定1次，连续测定5次。日间实验：配制标准样品溶液，等分成5份，每天取1份测定，连续测定5天。 样品采集及处理方法。尿样取自一服用联邦止咳露的病人。尿样萃取：取200uL尿样，加入20uLNaoH (2.5mol/L)， 再加入乙酸乙酯 2.00mL，旋涡振荡10 min， 离心5m in (3 000 r/min)， 取乙酸乙酯层，加入10 uL盐酸(0.05 mol/L)， 30℃下减压蒸干，残余物用200uL水溶解，得待测液。测定麻黄碱时，待测液再稀释6倍。 2 结果与讨论 2.1 扫集胶束电动色谱缓冲体系与有机改性剂的选择 本实验利用低 pH值抑制电渗流。在相应的 pH值下，考察了磷酸盐(pH=2.2)、丁二酸(pH=3.0)、酒石酸(pH=2.5)、乙二酸(pH=2.1)等缓冲体系。结果表明，在分离麻黄碱、可待因时，只有磷酸盐缓冲体系无杂峰、出峰稳定、峰形理想、基线平稳，所以选用磷酸盐体系。 考察了乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇及乙酰胺等有机改性剂对分离效果的影响，结果表明，5种有机改性剂均不同程度地改善峰形及分离度，但出峰时间延长，其中乙乙出峰峰形最好，分离度理想，出峰最快，故选乙腈作有机改性剂。考察了乙腈体积分数分别为10%、15%、18%、20%、25%时 ，对分离效果的影响。结果表明，随着乙腈体积分数的增加，2种样品分离度增大，但保留时间延长，当乙腈体积分数为18%时，分离度、峰形均理想，出峰快，因而选定18%乙腈。 在 pH为 2.0、2.2、2.4、2.6时，不经冲洗毛细管柱，连续3次进样考察麻黄碱、可待因的出峰情况。结果表明， pH对2种物质的分离度影响不大，但对峰高及峰形稳定性有一定影响，在 pH=2.2时，峰形的稳定性最好，随着 pH偏离2.2，峰形稳定性变差，因而选择缓冲体系的 pH为2.2，使其与磷酸的 pK 接近。在 pH=2.2时，考察了 NaH， PO浓度为0、10、20、30、40 mmol/L时的出峰情况，结果表明，NaH，PO4浓度增大时，样品的分离度小幅增大，出峰时间稍微延长，电流增大。NaH， PO4浓度为20 mmol/L时，2种样品具有足够的分离度，峰形稳定，保留时间短，电泳电流适中，因而选定 NaH， PO4的浓度为 20mmol/L。 2.2 SDS浓度的选择 考察了 SDS浓度为20、40、60、80、100 mmol/L时可待因、麻黄碱的出峰情况，结果表明，当SDS浓度增加时，峰高增大，出峰时间缩短。这可由 k=K(VIV)解释，其中k是保留因子，K是分配系数，V为胶束的体积，V为溶剂体积。可见 SDS浓度增大，k值增大，样品与胶束的作用越强，样品可浓缩到更高的浓度，因而峰高增大，且出峰时间缩短。但是 SDS浓度的增高会使 SDS在低导带中宽度增大，从而引起峰宽增大。本实验在 SDS大于80 mmol/L时，出现峰宽增大，峰高降低的现象，因而选择 SDS的浓度为 80 mmol/L。 2.3 分离电压、进样时间的选择 试验了电压为16、18、20、22、24kV时峰高及出峰时间的情况，结果显示，随电压升高，可待因和麻黄碱的峰高呈降低趋势，但出峰时间缩短。综合考虑峰高及出峰速度，选择 20 kV为分离电压。考察了扫集胶束法中进样时间为20、40、60、80、100s时，样品的出峰情况，结果表明，随着进样时间的延长，峰高呈增高趋势，但峰宽变大，柱效下降，当进样时间超过60s时，峰形稳定性下降，因而选择进样时间为60 s。 2.4 方法性能 在优化条件下，用系列标准溶液对方法的性能进行考察，结果见表1.I。可见，在一定范围内拟合曲线呈良好的线性关系。以标准品检验方法的检出限，根据信噪比(S/N)等于3，麻闲碱和可待因的检出限分别为0.173和0.333mg/L。以样品峰高为考察指标，经计算，扫集胶束电动色谱法对麻黄碱和可待因的富集倍数分别为6.5和4.5. 表1 扫集胶束方法的线性范围、回归方程、重复性及检出限 Table 1 Linearity，regression equation，rep roducibility of peak area，，aand LODs by sweep ing method |Sample Linear range o/(mg·L-l) Regression equation RSD(n=5)s./% LOD(n=3)p/(mg·L-1) Ephedrine(麻黄碱) 0.693~11.1 y=196x - 0.842 0. 999 3 4.3 0.173 Codeine(可待因) 1.33~16.0 y=69.3x+14.9 0.9993 2.6 0.333 2.5重重复性实验 在优化条件下，按照“1.2”方法进行日内、日间实验，统计结果见表2。可见扫集胶束法稳定性较好。 表2日内、日间相对标准偏差 Table 22 RSD of intra-day， inter-day by standard Sample RSD s./% Peak height Peak area Retention time Intra-day(n=5) Ephedrine(麻黄碱) 4.3 5.5 1.6 Codeine(可待因) 4.3 6.3 1.5 Inter-day(n=5) Ephedrine(麻黄碱) 6.3 7.2 3.2 Codeine(可待因) 3.4 9.3 3.1 2.6 实际样品分析及回收实验 将尿样按“1.2"项处理后，在优化条件下平行测定3次，电泳图谱如图1A-C所示，其中(Ⅰ)为测量可待因，(Ⅱ)为稀释6倍测量麻黄碱的情况。经计算，尿样中被测物的质量浓度(mg/L)及 RSD分别为：盐酸麻黄碱 14.8，3.9%；磷酸可待因1.87，1.3%。相比于文献「5]，病人尿液中麻黄碱和可待因的质量浓度较高。 向尿样中添加一定量的标准品，按“1.2"处理后，在优化条件下，进行回收率实验，结果见表3.可见用扫集胶束法测定尿液中的麻黄碱和可待因，结果准确。 图 1 尿样色谱图 Fig.1 Electropherograms of urine sample (A) urine samp le without extraction(未萃取尿样)，(B-I) blank urine sample(空白尿样)，(B-Il) blank urine sample spiked with standard (空白尿样加标)，(C) real sample(实测样品)； buffer： 20 mmol/L NaH， PO4 (pH=2.2)； SDS： 80 mmol/L； acetonitrile： 18%(by volume)；separation voltage：-20 kV； sample injection time： 60 s； height： 16.0 cm； 1. ephedrine(麻黄碱)， 2. codeine(可待因) 表 33尿样中2种被测物的回收率 Table 3 Recoveries of two analytes in urine sample Ingredient Added p/(mg·L) Found pr /(mg·L-) Recovery R/% Average recovery R/% RSD s./% Ephedrine(麻黄碱) 5.20 5.30 102 97 3.5 10.4 9.91 95 15.6 14.6 94 Codeine(可待因) 2.00 1.91 96 103 3.1 4.00 4.20 105 6.00 6.45 108 ( 参考文献： ) ( 陈义.毛细管电泳技术及其应用[M].北京：化学工业出版社，2000： 5-7. ) ( 孟品佳.毛细管电泳在线样品富集技术及在法庭科学中的应用[J].中国人民公安大学学报：自然科学版，2006， 12(2) ： 1-8. ) ( [3] QURNOJP，KMJB， T ERABE S Sweep ing. conce n tration mecha n ism and applica t ions to high-s e nsitivity analysis in cap illary electrophoresis[ J ] . J Chromatogr. A ， 200 2 ，965：357-37 3 . ) ( 41 QURNOJP， TERABE S Exceeding 5000 - fo l d concentration of dilute analytes in the micellar el e ctrokinetic chroma-tography[J ] . S cience， 1998， ：282：465-468. ) ( 刘庆艳，张朝辉，陈波，等.人尿液中麻麻碱和可待因的液-液-液微萃取高效液相色谱法测定[J].分析测试 学报，2 0 08，27(1)：26-29 ) ( 吴筠，崔凯荣.用GC-MS法测定尿中可待因及其代谢物的浓度[J].分析测试学报，1994， ， 13(3) ： 71-74 ) ( 饶毅，王义明，罗国安.毛细管区带电泳法测定复方磷酸可待因溶液有效成份[J].分析科学学报，2001，17 (3)： 1 82-185. ) ( 更正声明 ) ( 在本刊2008年增刊 (P145)中，耿岳等作者的论文题目现现印刷错误，实为 倍硫磷原药中杂质的质谱定性分析”，作者简介栏的 "第一作者”介绍应删去。本编辑部对于由此给作者及读者造成的 不便深表歉意。 ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net