丁公藤中东莨菪内酯含量检测方案(毛细管电泳仪)

Vol.47No. 5Sep. 2008第47卷第5期2008年 9月中山大学学报(自然科学版)ACTA SCIENTARUM NA TURAL UM UN VERSIATIS SUN YA TSENI 72中山大学学报(自然科学版)第47卷 丁公藤中东莨菪内酯含量的高效毛细管电泳电导法检测 黄宝美，姚程炜2，王志国，莫金垣’ (1.绵阳师范学院化学系，四川绵阳621000； 2.：中国空气动力研究与发展中心设备设计及测试技术研究所，四川绵四622653；3.中山大学化学与化学工程学院，广东广州510275) 摘 要：建立了测定丁公藤中东莨菪内酯含量的高效毛细管电泳-电导法，乙酸-乙酸安：乙酸铵浓度为20mmol/L)为电泳介质，在20kV高压， pH3.5条件下柱端电导检测了丁公藤中东莨菪内酯含量。文章着重探讨了缓冲溶液种类、浓度、酸碱度及其操作电压，进样时间，有机添加剂等条件对检测的影响。方法的线性范围为：5.0~200.0mg/L， 相关系数 r= 0.999 8， 检出限为 1.0 mg/L。结果表明该法简便、快速、准确，回收率较高，适用于丁公藤中东莨菪内酯含量的测定。 关键词：毛细管电泳；东莨菪内酯；电导检测 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：0529-6579(2008) 05-0071-03 丁公藤作为一种中草药它主要用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、坐骨神经痛、半身不遂、跌打肿痛。东莨菪内酯 (scopoletin)作为丁公藤的主要有效成分之一，具有一定的镇痛作用及明显的抗炎作用，故测定其含量具有实际意义。关于丁公藤成分测定方法主要有高效液相色谱法-7和薄层扫描法[8]。高效液相色谱法在测定复杂的实际样品时，存在色谱柱易被污染而报废，对样品的前处理要求严格，分析时间长，进样量大等缺点。高效毛细管电泳法对于样品的前处理要求没有那么严格，并有进样量少、环保、经济等优点，特别适合成分复杂的实际样品的检测分析。而电化学检测器可以自己组装，经济实用，也可以避免毛细管光程短，灵敏度低的缺点。目前尚未见用高效毛细管电泳对东莨菪内酯含量进行测定的报道，本文首次采用高效毛细管电泳法对东莨菪内酯的含量进行了测定，结果令人满意。 实验部分 1.1仪器与试剂 毛细管电泳仪，高压电源(北京彩陆科技有限公司)，毛细管电泳数据站(北京彩陆科技有限公司)， pH S-3C精密酸度计(上海电光器件厂)，石英毛细管柱 50 cm x50pm(i. d.)河北永年光导纤维厂)，东莨菪内酯对照品 (07682200103，中国药品生物检定所提供)，磷酸二氢钾，磷酸，乙酸钠，冰醋酸，乙酸铵，盐酸羟胺，以上试剂均为分析纯；所用水为二次蒸馏水。 1.2 标i准溶液，样品溶液和缓冲溶液的制备 精密称取东莨菪内酯对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液。 称取丁公藤生药粉末1.0000g， 置索氏提取器中，加甲醇30 mL提取5h，用甲醇定容于10mL容量瓶中，试验前用 0.45pm微孔滤膜过滤。 分别制备100 mmol/L的乙酸钠、乙酸、磷酸、磷酸二氢钾和乙酸铵的储备液，各取适量配成不同浓度比的体系。 1.3：实验方法 每次实验前依次用 0.1 mol/L NaOH溶液、双蒸水、缓冲溶液冲洗毛细管 5 min，可以将吸附在毛细管内壁上的物质有效地除去，既能保持一定的电渗流，又能保证实验的重现性。重力虹吸进样，进样高度 20 cm，时间10s，分离毛细管有效长度50 cm (50um)，分离电压20 kV。 2结果与讨论 2.1缓冲溶液(酸性)的选择 缓冲溶液直接影响离子的迁移和最后的分离。考察了几种缓冲体系，发现在碱性缓冲溶液中，东莨菪内酯的响应很差，这可能与东莨菪苷的水解有 ( 基金项目：四川省教育厅资助项目 ( 07zb041) ) ( 作者简介：黄宝美 ( 1979年生)，女，讲师； ； Email h b m@790117@yahoo. com.cn ) 关。考察了几种酸性缓冲溶液：乙酸-乙酸钠、磷酸二氢钾-磷酸和乙酸-乙酸铵体系。结果表明，乙酸-乙酸钠体系对东莨菪内酯的测定干扰影响较大且基线漂移较大；磷酸二氢钾-磷酸体系离子强度大，电导高，基电压较高，噪音较大，限制了对缓冲溶液浓度的使用；在乙酸-乙酸铵体系中峰形较好，酸度容易调节，本文选用乙酸-乙酸铵作为缓冲溶液体系。 在高效毛细管电泳中，缓冲溶液的浓度过大会产生焦耳热，导致峰形变差，为了获得良好的分离度和检测灵敏度，配制了乙乙铵浓度为(5~50mmol/L) 几种不同浓度的缓冲溶液，实验发现浓度较大时，基电压较大，背景电流较大，噪音增大，信号较差，通过实验结果比较，乙酸铵浓度为20 mmol/L时，峰形较好，因此本文选用 20 mmol/L的乙酸铵。 分别取 10 mL乙酸铵储备液用0.1 mol/L的HAc调制成 pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0的缓冲溶液，按实验方法进样分析，实验发现选择pH值为3.5时，峰形较好，噪音小，因此本实验选择缓冲溶液的 pH值为3.5。 2.2有机添加剂的影响 在缓冲溶液中添加有机溶剂可以增加样品的溶解性，也可以起到控制电渗流的大小和方向，达到增强分离选择性，缩短分析时间，提高分离度的目的。实验发现在缓冲液中加入乙醇可以降低缓冲溶液的背景电导，基线变得平稳，迁移时间变小，同时可以使峰形变得尖锐，但是乙醇的含量大于5%，会引起基线漂移，因此选择5%的乙醇作为有机添加剂。 2.3进样时间及外加高压的影响 采用虹吸进样，在一定的进样高度下，进样时间决定进样量的多少，实验选择进样高度为20cm，考察了进样时间对分离检测的影响。发现进样时间太短，达不到检测器的灵敏度，若进样时间超过10s， 峰拖尾现象较严重，这是因为进样时间过长，进样量增大，引起样品扩散，导致峰形扩宽，故选择进样时间为10s 分离体系的最佳外加电压值，与缓冲溶液的浓度(离子强度)及毛细管内径和长度有关，通常细内径的毛细管可以施加较高的分离电压。提高分离电压可以加快分析速度，改善分离度，同时也会使背景电离值增大。实验中考察了分离电压从10~30kV对分离的影响向(图1)，选择最佳分离高压20kV. 图1i高压对理论塔板数的影响 Fig.1 The effect of separation voltage on theoretical plate 2.4线性范围和咪密度实验 在最佳的实验条件下，将东莨菪内酯标准品进样6次，迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.52%和1.16%。在5.0~200.0mg/L范围内峰高(Y)与质量浓度(C)之间呈现良好的线性关系，其线性回归方程为：Y=20.3+ 42.6C，相关线性系数 r=0.999 8，检出限为1.0mg/L。 2.50样品测定和加标回收实验 按照1.3处理样品，并对其质量含量进行毛细管电泳测定，丁公藤中东莨菪内酯的质量含量为1.217 mg/g，最佳条件下毛细管电泳图如图2所示。精确称取上述含量的样品3份各0.5g左右，分别精密加入一定量的对照品，分别按1.3进行处理按照测定方法进样测定，并计算回收率(表1)。 图2东莨菪内酯对照品(a)和样品(b)的毛细管电泳图 Fig. 2 Electropherogram of scopoletin standard (a)and sample (b) 缓冲溶液：20mmol/LNHAc +p=5%乙醇； 分离电压：20kV；进样高度：20cm； 表1样品的回收率 Tab.1 Percent recovery of sample 本底值/ 添加量 测量值/ 回收率 (mg g) /mg (mg g ) /% 0.6125 0.1563 0.7681 99.6 0.6028 0.5214 1.1216 99.5 0.5823 0.7234 1.2987 99.0 3 ：结论 本实验采用毛细管电泳电化学方法测定了丁公藤中东莨菪内酯的含量，在优化的条件下6min内得到很好的分离，样品加标回收率较高，说明该法快速，准确，可望成为药品的含量控制方法。 ( 参考文献： ) ( [1]宋蔚，刘锁兰，李秀青，等.HPLC测定 4种丁公藤类生药中东莨菪素及东莨菪苷的含量[J].中国中药杂志， 2004，29(2)：185-186.LUSu o lan，LIXi uq ing， Ynag Jun， et al D e tem ination ofscopoletin and s copolind i n four Kinds of Caulis Erycibesby HPLC[J]. 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J G uangdong C o llege of Phamacy，2006，22(5)：503-505. ) Determ ination of Scopoletin in Caulis Eryc ibes by CapillaryElectrophoresis w ith Conductive D etection HUANG Baomei， YAO Chengwei， WANG Zhi-guo ，MO Jin-yuan (1. Chem ical Department ofM ianyang Nomal University， M ianyang 621000， China； 2. Facility Design and Instrumentation Institute of CARDC，M ianyang 6226533，China；3. School of Chem istry and Chem ical Engineering， Sun Yat sen University， Guangzhou 510275， China) Abstract A method for detem ination of scopoletin in Caulis Erycibes was established by high perfommance cap il-lary electrophoresis using conductivity detection system. Several parameters affecting the detemmination were stud-ied， including effect of organic concentration and running buffer， acidity， samp ling time and working voltage Un-der the following condions： HAcNHAc (NHAc 20 mmol/L， pH=3.5)， 20 kV operaion voltage， a linearityexists between peak height and mass concentration in the range of5.0~200.0mg/L， correlation coefficient valueis 0. 999 8， etemm ination lim it is 1. 0 mg/L. The results indicate that this method is simple， quick， accurate andhas high recoveryThis method is applied to detemm inate the content of scopoletin in Caulis ErycibesKey words：cap illary electrophoresis； scopoletin； conduc ie ion ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net