扑尔敏中对映体检测方案(毛细管电泳仪)

中国科技核心期刊hxyj @henu. edu.cn第21卷第1期2010年1月化 学 研 究CHEMICAL RESEARCH 77郑志侠等：基于环糊精手性选择剂的几种手性药物对映体的毛细管电泳拆分第1期 基于环糊精手性选择剂的几种手性药物对映体的毛细管电泳拆分 郑志侠，汪家权权，程 红，肖 萧 (1.安徽省环境科学研究院，安徽省污水处理技术重点实验室，安徽合肥230061； 2.合肥工业大学资源与环境工程学院，安徽合肥230009) 摘 要：以环糊精(cCDβCD 和CD)为手性选择剂，采用毛细管电泳对扑尔敏、异丙嗪和二氧异丙嗪对映体进行了分离，考察了手性选择剂的浓度、缓冲液pH值及有机添加剂对手性分离的影响，并就拆分机理进行了初步探讨. 关键词：手性药物对映体；扑尔敏；异丙嗪；二氧异丙嗪；环糊精；毛细管电泳；手性拆分 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 文章编号：1008-1011(2010)01-0076-04 Enantioseparation of Several Pharmaceutical Enantiomers byCapillary Electrophoresis with Cyclodextrins as Chiral Selectors ZHEN G Zhi-xia'， WAN GJia quan，CHENG Hong’， XIAO Pu' (1.Anhui Provincial Academy of Environmental Science， Anhui Provincial Key L aboratory ofWastewater Treatment Technology， Hefei 230061， Anhui， China；2. School of Resources and Environment， Hefei University of Technology， Hefei 230091 ，Anhui， China) Abstract ：Cyclodextrin (cCD，BCD andr-CD) were used as chiral selectors to separate chlorpheniramine， promethazine and dioxopromethazine enantiomers via capillary electrophoresis.The effects of the concentration of chiral selectors， pH value of buffer solution and organicmodifiers on the separation efficacy were investigated. Moreover， possible chiral separationmechanisms were briefly discussed. Key words ：pharmaceutical enantiomer； chlorpheniramine； promethazine； dioxopromethazine； .cyclodextrin； capillary electrophoresis； enantio separation 手性对映体尤其是手性药物的拆分近年来已成为分析化学领域的重要课题之一，这是由于手性药物的不同对映体的生化和药理作用往往存在差异，而其化学、物理性质非常相似，手性分离的难度较大.毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析时间短和仅需微量样品的优点，符合以生物工程为代表的生命科学各领域中对生物大分子(肽、蛋白、DNA等)的高度分离分析的要求，用CE直接分离手性对映体得到很快发展，尤其是对开发中的新药的对映体的分离和生物体内药物代谢过程中对映体的分离，更具有其独特的优点，正逐步成为生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段11-3].本文以环糊精为手性选择剂采用毛细管电泳对扑尔敏、异丙嗪和二氧异丙嗪药物对映体(结构如图1)进行分离，优化了手性选择剂的类型、浓度、缓冲溶液pH、有机添加剂等分离条件，并通过研究结构与分离的关系初步探讨了可能的拆分机理. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 CL1030型毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司)，含高压电源、紫外检测器及 HW-2000色谱工作站 ( 收稿日期：2009-07-30. ) ( 基金项目：国家科技部国际科技合作项目(2008DFA91310 &2009DFA93030)；安徽省优秀青年科技基金项目(08040106832). ) ( 作者简介：郑志侠(1973-)，女，高级工程师，博士，主要从事环境污染物分析研究 ) (千谱软件有限公司)；石英毛细管柱为58 cm ×50 um(I.D.)，有效长度50 cm(河北永年光导导维厂)；pB-10型pH计(北京赛多利斯科学仪器公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 扑尔敏、异丙嗪和二氧异丙嗪对映体(Sigma公司)，α环糊精β环糊精和丫环糊精(Applichem 公司).其它试剂均为分析纯，水为去离子水. (a)扑尔敏 图1 手性药物的结构式 Fig.1 Chemical structures of chiral drugs 1.2 实验方法 毛细管柱使用前分别用0.1 mol/L HCl，0.1 mol/L NaOH和超纯水冲洗5 min，最后用缓冲液平衡10min 后进样.每次分析后需用缓冲液冲洗2min 再进行下次分析.采用压力进样，进样压力3447.4Pa，进样时间5s，分离电压20kV，分离温度20 ℃，紫外检测波长214nm.配制30 mmol/LTris HCl缓冲液，调节.pH至设定值，缓冲液超声波脱气.将药品配制成10 mmol/L的储备液，于4 ℃保存，进样时用缓冲液稀释到所需浓度. 2 结果与讨论 2.1 手性选择剂的选择与浓度优化 实验采用30 mmol/L TrisHCl缓冲体系，分别以 αCDβCD和丫CD作为手性选择剂对3种手性药物对映体进行分离.结果表明，添加αCD 的条件下这三种药物对映体均无法实现分离；采用βCD时三种药物对映体可实现一定的分离；Y-CD 无法识别扑尔敏对映体，对异丙嗪和二氧异丙嗪有选择性，但异丙嗪在Y-CD下的分离度远低于在βCD存在下的分离度.这可能是由于0.CD 空腔太小，而药品的分子含有两个或三个环状结构难以进入空腔而无法实现手性拆分.βCD空腔大小适中，尤其适合扑尔敏这样两个苯环的分子结构，故而分离度最佳.对rCD而言，扑尔敏的分子太小而二氧异丙嗪分子合适，所以在添加加CD的缓冲液下，二氧异丙嗪得到最佳分离而扑尔敏未显示出分离度. 手性选择剂的浓度是影响手性拆分的一个重要因素.手性选择剂浓度太低，对映体的分离效果差；浓度过高，影响缓冲溶液的电渗流，溶液中各物质的电泳淌度也发生变化，从而影响分离度4.在30 mmol/LTrisHCl 缓冲溶液中，分别考察不同βCD 浓度下扑尔敏和异丙嗪对映体的分离情况(图2).当βCD浓度低于5 mmol/L时，扑尔敏对映体得不到分离，在βCD浓度为5~10 mmol/L之间时，扑尔敏的分离度随浓度的增加而增大，继续增加βCD浓度至15 mmol/L，分离度略有降低(图2a).扑尔敏在βCD浓度为10mmol/L时分离最佳. (a)扑尔敏 (b)异丙嗪 (c)二氧异丙嗪 图2 手性选择剂浓度对分离的影响 Fig.2 The effect of concentration of chiral selectors on enantio separation 异丙嗪在βCD浓度为0.5~5 mmol/L 之间对映体均有分离(图2b)，当βCD浓度高于7.5 mmol/L 时对映体得不到分离，从图2(b)可以看出，异丙嗪对应的的最佳βCD浓度为2.0 mmol/L.其分离度也同扑尔敏一样存在先上升后下降的趋势.这可能是由于βCD 浓度过低时不能形成足够浓度的包合物从而影响分离效果，过高时影响缓冲液的电渗流改变各物质的电泳淌度从而影响分离度. 对不同rCD浓度下二氧异丙嗪分离进行了考察，结果如图2(c).二氧异丙嗪随丫CD浓度的增加分离度迅速增大，在10 mmol/L时达到基线分离，之后随浓度变化不大.因此二氧异丙嗪的最佳YCD 浓度为10mmol/L. 最终得到各药品对映体分离图如图3所示. 图3 手性药物对映体分离图 Fig.3 Electropherograms of the separation of the selected drugs 2.2 pH值的影响 在 CZE分离中，电解质溶液的pH值是一个非常重要的影响因素，它不仅影响电渗流的大小，而且影响分离物的电离和络合，从而影响分离效率.本实验在最佳手性选择剂和最佳浓度条件下，分别考察了背景电解质溶液pH值(2~4.5)对分离的影响，结果如图4所示. 在pH2.0~3.0范围内，扑尔敏分离度随pH的升高而增加；当pH升高至4时，分离度则降低.在pH为3.0时，对映体的分离达到最佳.βCD在识别扑尔敏对映体时，分子中氯代苯基团进人环糊精憎水空腔形成疏水包合，吡啶环与手性碳原子所连的基团可与环糊精空腔周围的羟 图4 缓冲液pH对手性分离的影响 Fig.4 Effect of p H value of buffer onchiral resolution 基发生作用，所以扑尔敏对映体分离所对应的最佳pH 值与其吡啶环上氮原子的pKa(4.0)值相接近. 由图4可以看出在pH2.0~4.0范围内，异丙嗪分离度变化相对较小，对应的最佳缓冲液pH值为3.0.当pH大于4.0时，异丙嗪的分离度显著降低，是由于N原子质子化程度降低，氢键和静电作用减弱，同时电渗流变大使其与βCD的作用机会降低使得分离变差. 二氧异丙嗪分离度随pH值先增大后减小的变化趋势，在pH2.5时达到最大.二氧异丙嗪质子化程度随pH减小而增大，且溶液电渗流流pH减小而降低，有利于对映体的分离.但是pH值过低时(pH2.0)，样品的迁移时间延长，使其扩散效应增加，分离度反而有所下降. 2.3 有机改性剂的影响 在毛细管电泳中，环糊精是最常用的手性识别剂，在识别对映体时，对映体疏水部分有选择地进入到CD 水水空腔中，亲水部分与 CD 开口处的仲形基形成氢键，根据两对映体络合常数的差异达到手性分离的目的.有机改性剂通常能改变包合络合物的形成常数，从而改变手性选择剂的最佳浓度使分离效果变坏或改善.实验发现在缓冲液中添加甲醇或乙腈时，扑尔敏、异丙嗪的分离度略有降低；二氧异丙嗪的分离度 明显降低，其中乙腈的影响较大. 以甲醇或乙腈为有机改性剂会降低CD 的手性拆分能力，这是因为相对疏水的甲醇或乙腈有机溶剂添加到缓冲液中后会占据环糊精的部分憎水空腔，减少了药物对物体和空腔的亲合力，因而削弱了 CD 和样品结合的能力，使CD 对药物对映体的识别能力降低. 3 结论 环糊精类手性选择剂的类型与被分析物质分子的结构决定了二者相互作用的类型和强度，如果对映体分子的大小和憎水性与环糊精腔体相匹配，且和腔体周围基团发生三点作用，形成具有不同稳定常数的包合络合物，就可实现对映体分离.本实验中手性选择剂α CD 对各药品无手性识别作用，βCD 可以拆分扑尔敏和异丙嗪对映体，二氧异丙嗪在10 mmol/Lr-CD 条件下可实现完全分离.添加有机改性剂甲醇或乙乙后，各对映体的分离度均未得到改善，其变化与包合物的平衡改变程度有关. ( 参考文献： ) ( [1]李方，张莉萍，靳慧，等.以β环糊精及其衍生物为手性选择剂毛细管电泳拆分几种药物的旋光对映体[J].分析化学， 1997，25(6)：644-647. ) ( [2]刘玲，严子军，李湘.高效毛细管电泳法手性分离伪麻黄碱[J].理化检验(化学分册)，2007，43(7)：525-527. ) ( [3] Mikuě P ， K u bacak， Val kov aI， et al. An al ysis of e na n tiomers in biological mat r ices by c harged cyclodextrin mediated capillary zone electrophoresis in columncoupling arrangement with capillary isotachophoresis[J] . Talanta ， 2006 ，70：840-846. ) ( [4] 谢天尧，唐亚军，阮小林，等.手性药物异丙嗪对映体的毛细管电泳-方波安培法检测[].分析化学，2004，32(10)：1317- 1320. ) ( [5]徐佳.环糊精-毛细管区带电泳法分离手性药物对映体[J].国外医学：药学分册，1996，23(5)：275-279 ) ( [6] W ard TJ ， Nic h ols M ，Sturdivant L ，et al . Use of organic modifie r s to enhance chiral selectivity in capillary electrophoresis []. A mino Acids，1995 ，8(4)：337-344. ) (上接第75页) ( [6]范彬彬，宋明纲，晋春，等.金属配合物磷铝分子筛复合材料的制备.中国专利， CN 1308077C[P].2007. ) ( [7] G aillon L ， Sajot N ， B edioui F ，et al. E l ectrochemistry of zeolite-encapsulated complexes [J]. J Electroanal Chem ， 1993，345(1-2)：157-167. ) ( [8]郑东红，陆天虹，张存中，等.维生素B12修饰电极及其催化氧还原性质的研究[].物理化学学报，1997，13(9)：797 - 801. ) ( [9] Greef R ， Peat R， Pete r L M， et al.柳厚田，徐品弟译.电化学中的仪器方法[M].上海：复旦大学出版社，1992：186-191. ) ( [10] K umar S A ， C he n S M . El e ctrocatalytic r e duction of oxygen and h y drogen peroxide a t p o ly (paminobenzene sulfonic acid)-modified glassy carbon electrodes [ J ]. J M o l Catal A： Chem， 2007，278(1-2 ) ：244-250. ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net