新疆紫草中左旋紫草素的含量检测方案

高效毛细管电泳法测定新疆紫草中左旋紫草素的含量 白研*，毋福海，罗碧莲，曾春丽(广东药学院公共卫生学院，广州市510310) 中图分类号 R284.1；R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)19-1790-03 摘 要 目的：建立以高效毛细管电泳-紫外检测法测定新疆紫草中左旋紫草素含量的方法。方法：分离柱为未涂层弹性融硅石英毛细管(53 cmx50 um ID，有效长度46 cm)，电泳介质为2.0 mmol·L飞'HBOs+6.0 mmol·L'三乙胺缓冲液+5.0 mmol·L-β-环糊精，分离电压为14kV，重力进样时间15s(高度25 cm)，检测波长为516 nm。结果：左旋紫草素的检测浓度在7.2~36.0 ug·mL范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.9990)；平均回收率为 100.15%，RSD=1.68%(n=6)。结论：本法简便、快速、准确、可靠，可用于新疆紫草中左旋紫草素的含量测定。 关键词 高效毛细管电泳法；新疆紫草；左旋紫草素；含量测定 Content Determination of Shikonin in Arnebia euchroma by HPCE BAI Yan， WU Fu-hai， LUO Bi-lian， ZENG Chun-li(School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical Uni-versity， Guangzhou 510310， China) ABSTRACT OBJECTIVE： To determine the content of shikonin in Arnebia euchroma by HPCE-UV. METHODS： The separa-tion was performed on uncoated fused silica capillary column (53 cmx50 pm ID， 46 cm effective length). 2.0 mmol·LHBO：， 6.0mmol·Ltriethylamine buffer solution and 5.0 mmol·Lβ-CD was used as background electrolyte， 14kV separation voltage andtime of gravity injection 15 s (25 cm). The detection wavelength was set at 516 nm. RESULTS： The linear range of shikonin was7.2~36.0 ug·mL(r=0.9990) with an average recovery of 100.15%(RSD=1.68%，n=6).CONCLUSION： The method is conve-nient， rapid， accurate and reliable for the content determination of shikonin in A. euchroma. KEY WORDS HPCE； Arnebia euchroma； Shikonin； Content determination 紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma.(Royle)Johnst.或内蒙紫草 Arnebia guttata Bunge 的干燥根21。前者习称“软紫草”，后者习称“硬紫草”。其中新疆紫草更为常用，其味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有凉血、活血、解毒透疹等功效。临床常用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疱痒、阴道炎、婴儿皮疹、水火烫伤等，具有很强的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、保肝和调节免疫等作用。紫草根部含有萘醌类色素，包括紫草素、乙酰紫草素、丙烯酰紫草素、异丁酰紫草素、，β-二甲基丙烯酰紫草素等多种色素成分，多以左旋紫草素的含量作为紫草提取物的检测标准。文献报道左旋紫草素的测定方法有薄层扫描法、高效液相色谱法5~71等。以毛细管电泳法进行测定，相关报道为采用高频电导检测器，而电化学检测普遍存在的弱点为重现性较差，以此作为药材的质量控制方法较为不利。本试验采用紫外检测器，通过改善一系列电泳条件，建立了对新疆紫草中左旋紫草素分离、测定的高效毛细管电泳(HPCE)法。 材料 1.1 仪器 CL1030 型 HPCE 仪(北京科陆科学仪器有限公司)；K-2501型紫外-可见检测器(德国诺尔公司)；HW-2000型色谱工作站(2.17版，南京千谱软件有限公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)；DL-360型超声波清洗器(宁波市石浦海天电子仪器厂)。 1.2 试药 ( *副教授，硕士 。 研究方向：药物分析与卫生检验。电话 ： 020- 34055161 。E -mail：angell _ bai@163.com ) 左旋紫草素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0769-9903)；新疆紫草药材购自北京同仁堂，经广东药学院中药学院孟江副教授鉴定为真品；所用试剂为优级纯或分析纯，水为二次蒸馏水。 2方法与结果2 溶液的制备 2.1.1 对照品贮备液 精密称取左旋紫草素对照品9.0 mg，加适量甲醇溶解后定容至25 mL， 即得(360.0pg·mL)，4℃贮藏。临用时稀释成各浓度的对照品溶液。 2.1.2 供试品溶液 精密称取适量干燥的紫草粉末，置于50mL锥形瓶中，加甲醇25mL，准确称量，超声30 min，放冷，补充甲醇至初始质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，续滤液用0.45 um滤膜过滤，即得。 2.2 电泳操作条件 采用未涂层弹性融硅石英毛细管(53 cmx50 um ID，有效长度46cm)，运行电压14kV，重力虹吸方式进样，高度25 cm，进样时间15s，紫外检测波长516 nm。试验在恒温(25℃)、恒湿(60%)条件下进行。 毛细管在使用前，依次用二次蒸馏水冲洗 10 min、0.1mol·L'NaOH溶液冲洗5 min、二次蒸馏水冲洗5 min、运行缓冲溶液冲洗 10 min，所需电泳缓冲液均经过超声脱气20 min。在2次运行之间，用运行缓冲溶液冲洗2 min 2.3 电泳条件的优化 2.3.1 缓冲溶液的选择 试验考察了 Tris- 盐酸(pH7.0~9.0)、Tris-H BO：(pH 7.5~9.0)、NazHPO-NaHPO4(pH 6.6~7.8)、朋砂-HAc(pH7.0~8.5)、HBOs-三乙胺(pH7.5~9.2)、HBOs-二乙胺(pH7.5~9.2)缓冲体系。此外，还检测了 Tris- 柠檬酸(pH 7.0~9.0)、H；BOs-硼砂(pH 7.4~9.0))、HBOs-NaCl-硼砂(pH 7.0~9.2)、硼砂-KHPO(pH 7.0~9.2)、硼砂-NaCOs(pH9.2~1.0)、硼砂(pH9.2)对样品中左旋紫草素分离效果的影响。结果发现，在H，BOs-二乙胺和HBOs-三乙缓缓冲体系中，左旋紫草素出峰相对较好。又比较 HBOs-二乙胺和HBOs-三乙胺2种缓冲体系，发现在HBOs-二乙胺缓冲体系中，背景噪声和拖尾因子较大；在HBOs-三乙缓缓冲体系中，左旋紫草素与其衍生物的分离效果较好，基线平稳，故最终选用了H；BOs-三乙胺缓冲体系。 由于考虑到运行缓冲液的浓度及配比影响被测物的分离度与迁移时间，故试验中利用正交试验法考察了 HBOs与三乙胺不同浓度及配比对左旋紫草素及其衍生物分离情况的影响，得出2.0mmol·L'H，BO：+6.0 mmol·L'三乙胺的缓冲体系分离效果最佳。 2.3.2 有机改性剂的选择 在电泳过程中，缓冲溶液中加入有机溶剂可以影响介质黏度、介电常数及双电层结构等，进而影响电渗流及迁移行为，达到调节选择性、改善分离度的目的试验中考察了乙醇、甲醇、丙二醇、丙酮、-环糊环(β-CD)、十二烷基硫酸钠(SDS)等几种添加剂不同加入量对分离和检测的影响，发现缓冲溶液中加入β-CD时，可使左旋紫草素峰形变得尖锐，峰高、峰面积明显增大。比较加入不同浓度的-CD对左旋紫草素分离的影响，发现加入5.0mmol·L'β-CD分离效果最好，其它几种添加剂对分离检测无改善。因此，后续试验选择添加5.0 mmol·L'B-CD 的2.0 mmol·L'HBOs+6.0 mmol.L'三乙胺缓冲体系(pH8.9)作为电泳介质。 2.3.3 分离电压和进样时间的选择 试验考察了8.0~23.0kV电压范围内样品的分离情况，综合考虑分离度、分离时间、峰展宽、灵敏度、噪声等因素，优化选择14 kV为分离电压。 进样时间决定了进样量的大小，时间太短会影响检测的灵敏度，时间太长又会影响分离效率和分离度。本试验以重力进样，进样高度为25 cm，在14kV分离电压下，考察了进样时间对分离效果的影响，选择最佳进样时间为15 s. 在上述优化试验条件下的电泳图见图1。 mV 图1 毛细管电泳图 A.对照品；B.紫草；1.左旋紫草素；2.甲醇；3.未知物 Fig 1 Capillary electrophoretogram A. control substance； B. A. euchroma； 1.shikonin； 2. methanol； 3.unk-nown substances 2.4 精密度试验 在优化电泳条件下，分别取10.8、25.2 ugmL2种浓度的左旋紫草素对照品溶液，各重复进样6次，测定峰面积。结果，RSD分别为1.60%、1.63%，表明仪器精密度良好。 2.5 线性关系考察 取适量对照品贮备液，分别加甲醇稀释成含左旋紫草素7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8、36.0ug·mL'的系列标准溶液，在优化电泳条件下重力进样测定。以对照品峰面积积 分值(Y)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=578.24C-431.18(r=0.9990)。结果表明，左旋紫草素检测浓度在7.2~36.0pug·mL'范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。 2.6 稳定性试验 精密称取紫草药材粉末 0.9 g，加甲醇25mL，按“2.1.2”项下方法处理后稀释2倍，分别在0、2、4、6、8、10、12h按优化电泳条件分析测定。结果，RSD=0.85%，表明供试品溶液在12h内测定结果稳定。 2.7 加样回收率试验 精密称取0.050g紫草药材粉末6份，将左旋紫草素对照品按3种水平分别加入紫草紫品中，各平行2份，按“2.1.2”项下方法处理后在优化电泳条件下进样分析，计算加样回收率，结果见表1。 表1 加样回收率试验结果(n=6) Tab 1 Results of recovery test(n=6) 样品含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% x/% RSD/% 0.193 0.108 0.3005 99.54 0.193 0.108 0.3023 101.20 100.15 0.193 0.144 0.3407 102.60 1.68 0.193 0.144 0.3382 100.80 0.193 0.180 0.3705 98.61 0.193 0.180 0.3697 98.17 2.8 样品含量测定 精密称取适量紫草粉末，平行6份，以甲醇为溶剂，液料比为50：1，室温下超声30 min，按照“2.1.2”项下方法分别制备供试品溶液，在优化电泳条件下分别测定。结果，样品中左旋紫草素的平均含量为3.85 mg'g'，RSD=2.32%。 3 讨论 本试验以紫外检测器建立了测定左旋紫草素的 HPCE法。通过对缓冲溶液组成、pH值、浓度、添加有机改性剂以及分离电压和进样时间对左旋紫草素与其衍生物分离情况的影响研究，确立了实现左旋紫草素与其衍生物有效分离的HPCE条件。在此条件下，左旋紫草素保留时间约为5 min，与相关文献比较分离时间缩短。 试验中供试品溶液是以甲醇为溶剂、超声提取紫草样品而得，经正交试验优化左旋紫草素提取工艺条件，在此条件下左旋紫草素含量为3.85 mgg，与相关文献比较测定含量相符，但本试验以甲醇为溶剂提取左旋紫草素使收率有一定提高。 ( 参考文献 ) ( [1] 唐汉均，王春丽.麻油提取紫草工艺条件优选[J].上海中 医药杂志，2005，39(11)：58. ) ( [2 ] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005 年 版.北京：化学工业出版社，2005：238. ) ( [3] 李晓瑾，谭秀芳，马 媛，等.药用植物紫草的研究进展 [J].新疆师范大学学报，2005，24(4)：69. ) ( [4 ] ] 刘 芳，王小平，伍伟祯.薄层扫描法测定烧伤膏中左旋 紫草素的含量[].基层中药杂志，2001，15(2)：21. ) ( [5 ] Y ani H u， Zhihong Jiang， Kelvin Sze- Yin Leung， et al.Si-multaneous determination of naphthoquinone derivativesin Boraginaceous herbs b y high-performance liq u id chr - ) HPLC法测定眼保Ⅱ号胶囊中大黄酚的含量 张培琴*(贵阳中医学院第一附属医院，贵阳市550001) 中图分类号 R283.65；R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)19-1792-02 摘 要 目的：建立以高效液相色谱法测定眼保Ⅱ号胶囊中大黄酚含量的方法。方法：色谱柱为 Agilent Ci8(150 mmx4.6 mm，5um)，流动相为无水乙醇-0.1%磷酸水溶液(87：13)，流速为1.0 mL·min'，检测波长为254 nm。结果：大黄酚进样量在0.0426~0.3408 ug范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9999)；平均回收率为99.39%，RSD=1.74%(n=6)。结论：本方法简便、准确、灵敏、重复性好，可用于眼保Ⅱ号胶囊的质量控制。 关键词 高效液相色谱法；眼保Ⅱ号胶囊；决明子；大黄酚；含量测定 Content Determination of Chrysophanol in Yanbao I Capsule by HPLC ZHANG Pei-qin (The First Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang550001， China) ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a HPLC method for the content determination of chrysophanol in Yanbao Ⅱ capsule.METHODS： The separation was performed on Agilent Ci8(150 mmx4.6mm，5 um) column with absolute alcohol- 0.1% phosphoricacid (87：13) as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min and the detection wavelength was set at 254 nm. RESULTS： The linearrange of chrysophanol was 0.042 6~0.340 8 ug(r=0.999 9) with an average recovery of 99.39%(RSD=1.74%，n=6).CON-CLUSION： Themethod is simple， accurate， sensitive and reproducible for the quality control of Yanbao Ⅱ capsule. KEY WORDS HPLC； Yanbao Ⅱ capsule； Cassia obtusifolia； Chrysophanol； Content determination 眼保Ⅱ号胶囊是我院老中医经过几十年临床经验，根据中医药学理论研制而成的纯中药复方制剂，由决明子、丹参、山药、茯苓等15味中药组成，具有清肝养肝、滋肾明目之功效，主要用于近视、视疲劳、眼底血管病变、眼底视网膜病变的治疗。目前，其质量标准仅有常规胶囊剂检查项目和薄层色谱定性鉴别，未对处方中主要有效成分建立质量控制项目。决明子为方中君药，性味甘、苦、咸、微寒，归肝、大肠经，始载于《神农本草经》，具有清热明目、润肠通便之效，主治目赤赤痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结。多年来，国、内外学者在决明子的化学成分方面做了大量研究，发现决明子中含蒽醌类、萘骈吡喃酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等，主要成分为蒽醌类，其中大黄酚为主要有效成分"。因此，笔者以2005年版《中国药典》(一部)决明子的含量测定方法为依据，对眼保Ⅱ号胶囊中决明子的主要有效成分——大黄酚进行了含量测定。 1 材料 1.1 仪器 1100型高效液相色谱(HPLC)仪，包括四元泵、自动进样器、VWD检测器、柱温箱、1100化学工作站(美国Agilent公 ( omatography[J].Analytica Chimica Acta，2006，577：26. ) ( [6] 郭红军，简丽娜，孔焕宇，等.高效液相色谱法测定玉红膏 中紫草素的含量[J].时珍国医国药，2006，17(4)：489. ) ( [7] 许红兰，姜 .哲.HPLC法测定复方紫草油中左旋紫草素 .的含量[].现代医药卫生，2008，24(21)：3211. ) ( *副主任药师。研 究 方向：中药学。电话：0851-8612501。 E - mail：zhangpeiqin@126.com ) 司)；AB265-S型电子分析天平(瑞士Metler Toledo 公司)；KQ-200KDB型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。 1.2 试药 大黄酚汉照品(中国药品生物制品检定所，批号：110769-200514)；眼保Ⅱ号胶囊(本院自制，规格：每粒0.44g，批号：080701、080805、080909、080923、081125)；决明子药材(贵州贵阳济仁堂中药饮片厂，批号：20080402)；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。 2方法与结果2 色谱条件 色谱柱：Agilent Cis(150mmx4.6 mm，5 um)；流动相：无水甲醇-0.1%磷酸溶液(87：13)，用前以0.45 um微孔滤膜虑过；流速：1.0mL·min；检测波长：254nm；柱温：25℃。理论塔板数按大黄酚计算应不低于3000。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液 精密称取大黄酚对照品适量，加无水乙醇-乙酸乙酯(2：1)制成浓度约20 ug·mL'的溶液，摇匀，即得。 2.2.2 供试品溶液 取样品约5.0 g，精密称定，置具塞瓶中， ( 李全文，陈光，周 勰，等.毛细管电泳法测定紫草中的 紫草 素 [J].分析化学，2006，34(7)：991. ) ( [9] 明永飞，孙玉希，尤进茂.氨基酸衍生物在毛细管区带电 泳下的分离研究[].化学研究，2003，14(3)：9 ) ( [101 白 研，宋粉云，毋福海，等.正交试验优选紫草提取工艺 [J ] .中药新药与临床药理，2006，17(4)：288. ) ( (收稿日期：2010-01-04 修回日期：2010-03-22) ) oinaraarmasx Yobuha electronic Publishing House. All rights reS reservec 围药房第 China Pharmacy Vol. No.◎ 岁药房?第第 Journal Electronic Publishing House. All rights resbinee p：//Www.cnki.net