芦荟中芦荟苷检测方案(毛细管电泳仪)

应用化学CHNESE JOURNAL OF APPL IED CHEM ISTRY第26卷第3期2009年3月Vol 26 No 3Mar 2009 第3期黄宝美等：高效毛细管电泳安培法测定芦荟中芦荟苷的含量303 高效毛细管电泳安培法测定芦荟中芦荟苷的含量 黄宝美 姚程炜" 边清泉" 王志国“ 莫金垣 (“绵阳师范学院化学系 绵阳 621000；中国空气动力研究与展展中心设备设计及测试技术研究所 绵阳：中山大学化学与化学工程学院 广州) 摘 要 建立了芦荟中芦荟苷含量的高效毛细管电泳安培检测方法。探讨了缓冲溶液种类、浓度、酸碱度，工作电位，有机改性剂及其操作电压、进样时间等对检测的影响。NaBO，NaoH(NaB0，浓度为30 mmol/L)为缓冲液，工作电位为-0.8V，体积分数为2.5%甲醇为有机添加剂，进样时间为10 s，在15kV分离高压，pH=9.5的碱性条件下柱端安培法检测了芦荟苷的含量。该法的线性范围为50~0.05mg/L，线性方程Y=856.2+123.3c，相关系数 r=0.999 4，检出限为 0.01 mg/L. 关键词 毛细管电泳，芦荟苷，安培检测 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0518(2009)03-0302-04 芦荟(Aloe)为百合科多年生常绿肉质植物，性寒味苦，具有健胃催泻，杀菌解毒，增强内脏功能，调节内分泌系统，软化血管，降低胆固醇，抑制黑色素形成等多种药理作用，芦荟的主要有效成分为芦荟苷(barbalion)。目前，对于芦荟苷含量的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)1~3]极谱法4]分光光度法51比色法16]毛细管电泳光检测法等。高效液相色谱法在测定复杂的实际样品时，存在色谱柱易被污染而报废，对样品的前处理要求严格，分析时间长，进样量大等缺点；而毛细管电泳安培检测法(CE-AD)对具有电化学活性的药物成分分析具有明显的优越性，比紫外检测法灵敏度高、分离效率高、受干扰小，设备可以自己组装，便宜，特别适合成分复杂的实际样品的检测分析。本文建立了毛细管电泳安培检测法(CE-AD)测定芦荟苷的含量，比文献报道方法检出限低，灵敏度高，为扩大芦荟资源的应用提供了可靠的科学依据。 Scheme 1 Chem ical structure ofBarbalion 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 高压电源(北京彩陆科技有限公司)，CES98-AD-B型安培检测器(北京彩陆科技有限公司)。三电极体系：Pt片辅助电极、碳纤维电极和饱和甘汞电极。毛细管电泳数据站(北京彩彩科技有限公司)，pH S-3C型精密酸度计(上海电光器件厂)，石英毛细管柱，45 cm X50 um。芦荟苷对照品((中国药品生物制品检定所)。 磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)，硼酸(H Bo)，硼砂，甲醇，邻苯二甲酸氢钾(KHP)，NaOH，以上试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。 ( 2008-03-09收稿，2008-06-14修回 ) ( 四川省教育厅资厅项目(07zb041) ) ( 通讯联系人：黄宝美，女，硕士研究生，讲师； Email： hbm790117@yahoo. com. cn； 研究方向：毛细管电泳分析 ) 1.2 溶液的制备 精密称取芦荟荟对照品 5mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液。 取芦荟生药研磨后的粉末约 0.5 g，精密称定，置50mL容量瓶中，以体积分数50%甲醇为提取溶剂，超声提取 30min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45 um微孔滤膜滤过，即得样品溶液备用。 分别制备i1100 mmol/L的硼砂，硼酸，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，Tris的储备液，各取适量配成不同浓度比的体系，即得缓冲溶液。 1.3 实验方法 进样前，毛细管依次用0.1 mol/L的 NaOH、二次蒸馏水和缓冲溶液各冲洗约5min，每2次进样之间用缓冲液冲洗2min，以保证其重现性。本实验用柱端安培检测，三电极体系：碳纤维电极，饱和甘汞电极，Pt对电极。采用重力进样方式，进样高度20cm，时间10 s，分离毛细管长度45cm，内径50 um，分离电压15kV。 2 结果与讨论 2.1 工作电位的选择 在毛细管电泳仪上考察了芦荟苷的动态伏安(见图1)。由图可见，从·2.0~+0.0V，峰电流不断增加，-0.8V达到最大，电位再往正移，峰电流又有所减小，因此本文选择-0.8V为检测电位。 2.2缓冲溶液的选择 实验分别考察了KHP、NaOHNa B4O、Tris-H，BO磷酸盐4种不同体系对分离的影响。实验发现，其中磷酸盐的缓冲溶液基线噪音和基线偏移均较大；KHP体系和 Tris-H BO中峰电流较小，峰拖尾严重，灵敏度较低；而 NaOHNaB4O，缓冲溶液中峰形较理想，灵敏度较高，本文选择 NaOHNa B40，为最 佳缓冲溶液。缓冲溶液浓度不仅影响分离时间也会影响安培响应，因此，选择合适浓度的缓冲溶液对毛细管电泳安培检测非常重要。实验发现，随着B4O，浓度增大，迁移时间延长，这是因为离子强度大，压缩了双电层，导致 Zeta电位降低，电渗流减小，从而迁移速度减小。当浓度高于30mmol/L时，焦耳热明显增大，区带展宽严重，基线噪音也增大。综合考虑到分离时间和峰形的影响，本文选择浓度为30mmol/L的硼酸盐。 对于石英毛细管，溶液 pH值增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁 zeta电势增大，电渗流增大；考察了5种不同 pH值(8.0、8.5、9.0、9.5，10.0)对迁移时间和峰形的影响。实验发现，随着 pH值的增大，迁移时间减小，综合考虑峰形，迁移时间，柱效的影响，本文选择 pH=9.5. 图1 芦荟苷的动态伏安图 Fig1 Hydrodynam ic voltammogram of BarbalionBackground：NazB40，NaOH， pH=9.5 separation voltage： 15 kV； inject hight 20 cm； inject tme： 10 s 2.3 有机改性的选择 有机改性剂对于改善峰形和提高分离度均是很重要的。实验发现，在缓冲液中加入甲醇可以使峰形变得尖锐，有助于提高分离度；但甲醇的含量太高，甲醇挥发，引起缓冲溶液组成变化，从而引起基线漂移。本文选择体积分数为2.5%的甲醇作为有机改性剂。 2.4 分离高压及进样时间对分离的影响 分离高压是毛细管电泳的驱动力。电压越高，组分迁移越快，分析时间越短，但是电压升高，使柱内焦耳热增加，电流增大，并且易发生气泡割断现象，对工作电极也有一定影响。在一定范围内，柱效随着电压增大而增大，过了极点，随着电压升高，焦耳热的影响更大，柱效反而降低。实验采用瞬间加压的恒电压工作方式，考察了10~30 kV高压对柱效的影响(如图2)，选择电压为 15 kV。 采用虹吸进样，在一定的进样高度下，进样时间决定进样量的多少，本文选择进样高度为20cm，考察了进样时间对分离检测的影响。实验发现，进样时间太短，达不到检测器的灵敏度；若进样时间超过10 s，峰拖尾现象较严重。这是因为进样时间过长，进样量增大，引起样品扩散，导致峰形扩宽，故选择进样时间为10 s. 2.5 方法的精密度和线性范围 在最佳的实验条件下，将芦荟苷标准品进样6次，迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为2.1%和3.5%。芦荟苷在0.05~50mg/L范围内峰高(Y)与质量浓度(c)之间呈现良好的线性关系，回归方程为Y=856.2+123.3c，r=0.999 4，检出限为 0.01 mg/L。 图2 分离高压对迁移时间和理论塔板数的影响 2.6 样品测定及加标回收实验 按本文1.2节方法制备样品，用外标法定量，进行回收测定，平均回收率为100.3%，结果令人满意。在最佳条件下，样品的毛细管电泳图如图3所示。 图33芦荟苷标准品(a)和芦荟样品(b)的毛细管电泳图 Fig 3 Electropherogram s of (a)Barbalion standard and (b) sample buffer solution： NaOHNazB407 (concentration ofNazB407 is 30 mmol/L，pH=9.5)；separation voltage： 15 kV； inject hight 20 cm； inject time： 10 s 表11样品的回收率 Table 1 Sam ple recovery rate Added/(mg·L-) Founded/(mg·L) Recovery rate/% Added/(mg·L) Founded/(mg·L) Recovery rate/% 1.00 1.01 101.02.00 1.99 99.5 5.00 5.02 100.4 ( 参 考 文 献 ) ( CHEN H ui(陈惠)，JANG XiuMei(姜秀梅)，WANGQiao-Feng(王巧峰)，ZHOU Jun(周军). J Fourth M ilitary M edi- calUniv (第四军医大学学报)[J]，2005，26(12)：1070 ) ( 2 MA Jing-Jun(马晶军)， FANG Zheng(方正)，WU Qiu-Hua(吴秋华)， SUN H u an M ing (孙奂明) ， WEN Y a -Jun(温雅君) . J HebeiAgriculture Univ (河北农业大学学报)[J]，2005，28(2)：57 ) ( 3 GUO H ua(郭华)，HOU Don g -Yan(候冬岩)，HU IRui-Hua (回瑞华)，LI Tie - Chun(李铁纯). Life Sci I nstrum ents (生 命科学仪器)[J]，2006，4(2)：32 ) ( LIQiLong(李启隆)，REN Li(任莉)，HU Jin B o(胡劲波). Acta Pham aceutica Sin(药学学报)[J]，1997，32(9)： 691 ) ( 5 CHEN Wei(陈伟)，LNXin-Hua(林新华)，HUANGLi-Ying(黄丽英)，LUO HongBin(罗红斌). Chinese J M odem Appl Pham acy (中国现代应用药学杂志)[J]，2002，19(5)：398 ) ( 6 GUO ShengWei(郭胜伟)， ZHAO Yi-Ping(赵逸萍). Chinese A rch ives Traditional Chinese M edicine (中医药学刊)[J]，2004，22(3)：323 ) ( 7 WANG De-Xian (王德先)， YANG GengLiang(杨更亮)，WANG L in-Ying(王琳颖)， SONG Xiu-Rong(宋秀荣). Chinese J Chrom atogr(色谱)[ J ]，2000，18(5)： 424 ) Determ ination of Barbalion n Aloe by CapillaryElectrophoresis Coupled with Am perom etric Detection HUANG BaoMer， .YAO Cheng-Wer， B AN QingQuan"， WANG Zhi-Guo"， MO Jin-Yuan ("D eparm ent of Chem istry， M ianyang Nom al College，M ianyang 621000；Institu te of Facility Design and Instrum en tation， CARDC，M ianyang； School of Chen istry and Chen ical Engineering， Zhongshan University， Guangzhou) AbstractBarbalion in A le was detemm ined by cap illary electrop hore sis coup led with amperometric detection(CE-AD). The pH， type and concentration of the running buffer， the detection potential， the applied voltageand the samp ling time were selected as the investigated variables Under the op tim ized conditions： a runninguffer composed of 30 mmol/L Na Ba O， buffer at pH 9.5， separation voltage at 15 kV， injection tme10 seconds， 2.5% methanol additive and detection potential -0.8V， a linearity existed between peak area(Y) and mass concentration ofBarbalion(c) in a range of 0.05~50 mg/L， r=0.999 4， and the detem ina-tion lim it was 0. 01 mg/L. Keywords cap illary electrophoresis， Barbalion， amperometric detection ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net