甘草中甘草次酸和阿魏酸检测方案(毛细管电泳仪)

第27卷第6期2008年 6月分析测试学报FENXICESHIXUEBAO (Joumal of Instrumental Analysis)Vol. 27 No.6611~614 612第27卷分析测试学报 电堆集-非水毛细管电泳分离测定甘草次酸和阿魏酸的研究 李利军，吴峰敏，，程 昊'，喻来波》，冯 军，吴健玲’ (1. 广西工学院 生物与化学工程系，广西 柳州 545006；2.河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471003； 3.广西大学 化学与化学工程学院，广西 南宁 530005) 摘 要：建立了电堆集富集-非水毛细管电泳(NACE)同时分离测定甘草中甘草酸和阿魏酸的新方法。系统研究了电压、非水溶剂、乙酸钠浓度、氢氧化钠浓度、样品溶剂等因素对电堆集和分离效果的影响，确立了分离和富集的最佳条件。以甲醇-乙腈(体积比4：6)为非水介质，30mmol·L乙酸钠-2.5mmol·L氢氧化钠为背景电解质；分离电压-20kV，检测波长254 mm。在优化条件下，甘草次酸在0.80~12.80 mg·L(r=0.999 6)，阿魏酸在 0.77~45.60mg·L(r=0.999 6)质量浓度范围内线性关系良好，回收率分别为97%~102%，98%~102%；甘草次酸检出限为 0.069 mg.L1阿魏酸检出限为 0.087 mg·L， RSD均不大于4.6%。 关键词：电堆集；非水毛细管电泳；甘草次酸；阿魏酸；甘草 中图分类号：0657.8；S567.71 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2008)06-0611-05 Simultaneous Separation and Determ ination of Glycyrrhetinic Acid and FerulicAcid by Sample Electrostacking-Non-aqueous Cap illary Electrophoresis LILi jun'， WU Fengmin， CHENG Hao， YU Lai-bo， FENG Jun， WU Jian-ling (1.DLeparment of B iological and Chem ical Engineering， Guangxi University of Technology， Liuzhou5545006， China；2Deparment of Chem ical Engineering and Phamacy， Henan University of Technology， Luoyang 471003， China；3.College of Chem istry and Chem ical Engineering， Guangxi University， Nanning5530005， China) AbstractAA new method for the simultaneous separation and detem ination of glycyrrhetinic acid(GA) and ferulic acid (FA) in liquorice by sample electro stacking- nonaqueous cap illary electropho-resis was pioposed The effects of separation voltage， non-aqueous solvent， concentrations ofNaAcand NaOH， and sample solvent were studied The operations were perfomed in a buffer system ofNaAc(30 mmol·L) and NaOH(2. 5mmol·L) in methanol- acetonitrile nonaqueousmedium ata separation voltage of-20 kV and the detection wavelength was set at 254 nm.The linear range ofthe calibration curve for GA was 0.80-12.80mg·Lwith a detection lim it of 0.069 mg·L andthat for FA was 0. 77- 45.60 mg·Lwith a detection lim it of 0.087 mg.L.The method hasbeen applied to the detemm inations of GA and FA in liquorice with satisfactory re sultsThe recoveryranges obtained for GA and FA were 97% -102% and 98%-102%， respectively， and the RSD wasless than 4.6%。 Key wo rds：3：sample electrostacking；non-aqueous cap illary electropho resis； glycyrrhetinic acid； ferulic acid： liquorice 甘草次酸和阿魏酸是多种中草药的主要活性成分，有重要的药理作用，据文献报道新疆甘草中含甘草次酸和阿魏酸-21。甘草次酸是经典的抗炎药物，应用于化妆品中可调节皮肤免疫功能，有效抑制酪氨酸酶的活化，阻止黑色素的产生，具有美白功效。阿魏酸(阿魏酸钠)具有抗血小板聚集、增强前列腺素活性、镇痛、缓解血管痉挛等作用，是生产用于治疗心脑血管疾病及白细胞减少等症药品的基本原料。它同时可起到保护皮肤的作用。在一些中草药中，这两种有机机的含量常被作为质量评 ( 收稿日期：2007-07-14；修回日期：2007-10-08 ) ( 基金项目：广西自然科学基金资助项目(桂科自0481019)；广西教育厅科学研究基金资助项目(桂教科[2000]392) ) ( 第一作者：李利军(1966-)，男，湖北黄梅人，教授，博士， Tel： 0772-2685028， E-mail： lilijun0562@ s ina. com ) 价指标，因此中草药中甘草次酸和阿魏酸含量的测定具有重要意义。分离测定甘草次酸和甘草酸的方法很多，主要有薄层扫描描[4-5]、高效液相色谱法(HPLC)[6-7]、高效毛细管电泳 (HPCE)等方法。HPCE具有分离效率高、消耗样品少、无需昂贵的色谱柱与复杂的前处理等诸多优点。应用于中药分析具有广阔的前景，但由于毛细管电泳柱上检测光程短，其浓度灵敏度比 HPLC低1~2个数量级 有文献报道毛细管区带电泳法(CZE)分离定定甘草次酸及阿魏!酸酸[9-13].，大都使用硼酸盐水溶 液为缓冲体系，对环境友好，但是检出限较高。由于甘草次酸和阿魏酸均较难溶于水，被测药品如甘草栓、甘草浸膏中含有多种疏水有机成分，在水系缓冲溶液中进行测定有一定的局限性。如果采用非水体系，可提高各种有机成分的溶解性，分析物可以有更宽范围的酸碱性、可以形成离子对、毛细管壁对疏水分析物的吸附减少[14]。本文首次采用了毛细管电泳电堆集富集技术测定甘草次酸和阿魏酸，用电堆集法提高了毛细管电泳分离测定的灵敏度，检出限低至几十个 ug/L。该法简便、快速、准确、重复性好、样品杂质干扰少，应用于甘草中甘草次酸和阿魏酸的测定，结果满意。 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，负电源：电压0~30kV可调；未涂层熔融石英毛细管细=75um，总长63cm，有效长度45 cm；检测波长254 nm。UV-2102PC型紫外-可见分光光度计(UN ICO instruments Co.， LTD)； DL-60D超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。 阿魏酸、甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所)。乙酸钠、氢氧化钠、甲醇、乙腈，均为分析纯。水为自制二次重蒸馏水。甘草为新疆甘草。 1.2 电泳条件 采用-20kV电压，重力进样30s(h=11.0 cm)；环境温度为25℃；缓冲体系以甲醇-乙腈(体积比4 ：6)为非水介质，含30 mmol·L配乙酸钠，2.5mmol·L氢氧化钠。实验时每3h更换1次缓冲液。 1.3 实验方法 1.3.1 毛细管的处理 每次实验前依次用1mol·LNaOH溶液、二次重蒸馏水、甲醇分别冲冼10min，进样前用缓冲液冲洗 30 min。实验结束后用二次蒸馏水冲洗，浸泡过夜。实验所用溶液进入毛细管前均用 0.45 um的滤膜过滤，并经超声波脱气。 1.3.2 样品预处理 取甘草10g干燥至恒重，中草药粉碎机粉碎成粉末(中≤380pm)，精密称取甘草粉末 0.5000g， 加入15.00mL甲醇溶液，超声提取90 min，冷却至室温，浸泡12h后过滤，滤渣用10.00mL甲醇超声提取60min后过滤，合并两次滤液，用0.45 pm滤膜过滤后取 5.00mL，定容至25.00mL，备用。 1.3.3 标准储备液的配制 精密称取甘草次酸对照品 0.0016g，用甲醇溶解，定容至10.00mL，配制成160 mg.L的甘草次酸对照品储备液；精密称取阿魏酸 0.0031g，用甲醇溶解，定容至10.00mL，配制成 310mg.L的阿魏酸储备液。 上述溶液均用0.45um滤膜过滤，超声脱气，置冰箱4℃保存。 2 结果与讨论 2.1 分离条件选择 2.1.1 检测波长的选择 以甲醇为参比液，在200~400nm波长范围对甘草次酸和阿魏酸溶液进行扫描，发现在254mm处两种酸均有较强吸收，故选取254mm作为检测波长。 2.1.2 分离电压的选择 实验考察了电压为18~28kV时的分离效果。在18kV时，两种酸的分离度比较高，基线稳定，但是迁移时间较长；在23kV时，迁移时间较短，但分离度较低；在分离电压高于25kV时，电流较高，由于焦耳热效应的影响，基线的稳定性下降、噪音增大、分离度降低、柱效下降。当电压为20kV时，分离时间、分离度、柱效均较理想，基线稳定，因而选用20kV作为分离电压。 2.1.3 缓冲体系的选择 (1)溶剂的选择 有机溶剂的种类对电渗流和样品电迁移速率有很大的影 响。在非水毛细管电泳中，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、乙醇、甲酰胺、乙酰胺和碳酸丙烯酯等，因酰胺类溶剂的紫外吸收太大，乙醇和碳酸丙烯酯的电渗流小。本实验采用甲醇和乙腈混合液为缓冲液溶剂，并考察了甲醇和乙腈不同体积比(3 ：7，4 ：6.5 ：5，6 ：4. 7 ：3)时的出峰情况，发现随着乙腈比例的增加，阿魏酸峰形逐渐变差，甘草次酸峰形逐渐变好；当甲醇与乙腈体积比为4 ：6时.阿魏酸和甘草次酸峰形都较好，并能与甘草样品中的干扰物3基线分离(见图1B)，且柱效高，因而本实验选择甲醇和乙腈的体积比为4 ：6. 图1 对照品(A)和样品(B)的毛细管电泳谱图 Fig.1 Electrophorogram s of reference standard(A) and liquorice extract(B) applied electrophoresis voltage：-20 kV； buffer solution： 30 mmol·L-NaAc-2.5mmol·L-NaOH，solvent： methanol- acetonitrile(4：6， by volume)； injection time： 30 s； injection height 11.0 cm1..ferulic acid(阿魏酸)； 2. glycyrrhetic acid(甘草次酸)； 3.3.unknown ingredient(未知物) (2)支持电解质浓度的影响 本文以乙酸钠为支持电解质，考察了不同乙酸钠浓度(20~50mmol·L)对各组分的迁移时间、分离度、柱效等的影响。结果表明随着乙酸钠浓度的升高，两种酸出峰时间先提前，后推迟，当乙酸酸浓度为30mmol·L时，阿魏酸和甘草次酸均在15min内出峰，峰形良好，柱效高，分离度高。当乙酸钠浓度大于 50 mmol·L时，电流值上升很快、噪音随之增大、基线漂移严重、灵敏度下降。综合考虑，选择乙酸钠浓度为 30mmol·L. (3)氧氧化钠浓度的影响 缓冲体系的pH值对电泳行为有一定的影响。在非水介质中无法准确测定溶液的 pH值，因此本实验通过改变氢氧化钠浓度调节并直接表示缓冲体系的酸度。考察了不同氢氧化钠浓度(0~3.5mmo1·L)对迁移时间的影响。当不用氢氧化钠时，甘草次酸和阿魏酸有很好的分离度，但迁移时间太长，不利于快速检测。随着氢氧化钠浓度的增加，两种有机酸出峰时间逐渐提前。当氢氧化钠浓度为2.5mmol·L时，分离度较好、柱效较高、分析时间较短。因此选择加入氢氧化钠浓度为 2.5 mmol·L. 2.1.4 电堆集富集条件的选择 (1)样品溶剂堆集效果的影响 在电堆集富集中，样品离子的富集率正比于样品溶液和背景电解质溶液的电阻率之比。因而在背景电解质确定的条件下，减小样品溶液的离子强度有利于获得较高的富集率。本实验在进样时间为30 s时，分别以电泳缓冲液、、1/2倍电泳缓冲液、1/4倍电泳缓冲液、甲醇、纯乙腈、甲醇-乙乙(体积比 4 ：6)为样品溶剂，考察了其对峰形的影响。结果表明，缓冲溶液稀释倍数越大，峰形越尖锐。当用纯甲醇、纯乙腈、甲醇-乙(体积比4 ：6)为样品溶剂时，峰高均比用以上3种电泳缓冲溶液作溶剂时增大，其中又以甲醇的峰高响应值最大，相比于以电泳缓冲液为样品溶剂的情况，阿魏酸和甘草次酸峰高分别增至2.2、2.8倍。本实验选用甲醇为样品溶剂。 表1 两种有机酸峰面积与进样时间线性方程、相关系数 (2)进样时间与富集倍数 在样品堆集富集方法中，为进一步提高检测灵敏度可采用大体积进样，以增加样品的进样量。但大体积进样会引起层流的增加，使峰展宽，从而降低分离效率。本实验考察了不同进样时间对两种酸测定的影响。实验结果表明，在20~200s内，甘草次酸和阿魏酸的峰面积响应信号(Y， uV·s)与进样时间(X，s)呈现出较好的线性，见表 1。但是，随着进样时间的延长，由于层流现象，致峰变宽严重，分 Table 1 The regression equation， correlation coefficientof glycyrrhetinic acid (GA) and ferulic acid(FA) ofthe plot of peak areas vs. the injection time Compound Regression equation Correlation coefficient r Ferulic acid(阿魏酸) Y=80.403X+15.289 0.9994 Glycyrrhetic acid Y=57.731X-128.35 0.999 0 (甘草次酸) 离度下降。对于标准品溶液，当选择进样时间为180s时，相比于无电堆集的情况，阿魏酸、甘草次酸的富集因子分别为6.8和17.1(计算公式 SE峰高=A大体积电堆集/A元推集)，检测灵敏度可大大提高。但是由于按样品处理项处理的甘草提取液组成仍较复杂，当进样时间超过30s，毛细管出现吸附现象，因而，实际样品测定时，本实验取进样时间为30 s. 2.2 线性关系的考察 配制系列标准溶液，在优化条件下，以甘草次酸和阿魏酸平均峰面积对浓度做工作曲线，线性方程、相关系数及检出限列于表2。可见，在一定浓度范围内标准曲线呈良好的线性关系，其相关系数均达到0.9996。基于3倍信噪比 (S/N=3)，甘草次酸和阿魏酸的检出限均低于 0.100mg.L。 表2两种有机酸的回归方程、相关系数及检出限 Table 2 The regression equations，correlation coefficients and detection lim its for GA and FA CompoundL Regression equation Correlation coefficient r Linearity range o/(mg.L-)Detection limit /(mg.L-1) Ferulic acid(阿魏酸) Y=770.37 X-358.71 0.999 6 0.77~45.60 0.087Glycyrhetic acid(甘草次酸) Y=864.50 X+172.84 0.9996 0.80~12.80 0.069 2.3 样品的测定与重复性实验 取同一规格、品种甘草样品5份，按样品预处理条件制备供试品溶液，在优化条件下对两种酸进行测定，电泳图谱见图1。经计算，在甘草提取液中甘草次酸和阿魏酸的含量分别为2.54g·L(RSD为2.6%， n=5)、0.67 g·L(RSD为1.3%， n=5)。 2.4稳定性实验 取上述对照品溶液，每隔1h进样，连续10h，结果表明10 h内甘草次酸和阿魏酸的峰面积积分值稳定， RSD分别为 4.2%、3.6%。 2.5 加标回收实验 在优化条件下进行加标回收实验，结果列于表3。甘草次酸的回收率在97%~102%之间，阿魏酸的回收率在98%~102%。RSD均小于 5.0%。可见该法具有较好的重复性和准确度，可应用于甘草中甘草次酸和阿魏酸的测定。 表3回收率实验结果 Analyte Originalp/(g·L) Found pp/(g·L-) RSD(n=5)s./% Recovery R/% Ferulic acid(阿魏酸) 0.77 0.79 2.6 102 6.10 6.12 2.3 100 24.8 24.37 1.3 98 Glycyrrhetic acid(甘草次酸) 1.60 1.63 3.6 102 6.40 6.21 4.6 97 12.80 12.40 3.6 97 ( 参考文献： ) ( 吴汉夔，赵芸，牟新利，等.新疆甘草化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2006，1 8 ： 8：415-417. ) ( 孙秀英，黄丽娟，刘霞.中药甘草化学成分分析[J].中医药学报，1994，5： 40-42 ) ( 柯铭清.中草药有效成分理化与药理特性[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1982：409. ) ( 程朱炉，何结宝.薄层-紫外法测定骨折宁颗粒剂中甘草次酸的含量[J].基层中药杂志，2000，14： 3 0. ) ( 方国英. TCL法测定宁心口服液中甘草次酸的含量[J].福建医药杂志，2004，2 6 ： 169-170. ) ( 吴瑛，袁守亮.反相高效液相色谱法测定野生甘草中甘草次酸含量 [J]. ： 分析仪器，2006，3：29-31. ) ( 沈金灿，庄峙厦，王小如. HPCE法与 HPLC法甘于甘草中主要活性成分甘草酸及其降解产物甘草次酸分析的比 较[J].药物分析杂志，200 6 ，26(4)：421-425. ) ( [8] ALBN M， GROSSMAN PD，MORNGSE S ensitivity enhancement f o r cap illary electrophoresis [J ]. Anal Chem，1993 . 65：489A-497A. ) ( [9] 尹茶，吴玉田.高效毛细管电泳法测定银翘解毒片中的氯原酸、甘草酸和甘草次酸[J].色谱，1999，17(2)：193 ) ( [10] 许重远，李国锋，陈志良，等.高效毛细管电泳法测定甘草栓中甘草酸与甘草次酸的含量[J].中成药，2000， 22(11)： 792-793. ) ( (下转第618页) ) 息，被当作光谱的慢变化部分去除了。 4 结 论 通过实验对气体吸收光谱的测量和处理，可以看出在差分吸收光谱分析中，该方法在拟合和去除光谱的慢变化部分比多项式拟合的方法相对准确，是一种新的光谱分析方法。同时，在提高分辨率方面有很好的作用，反演出的气体浓度也更加精确。在光谱处理方面，去除低频慢变化部分的同时可能损失了一部分气体吸收光谱中的有用信息；整个基线中也可能包含了部分污染气体的吸收信息和部分高频的噪音信息，所以可以通过去除频谱中一定低频段和高频段的信号，然后进行逆傅立叶变换来获取气体的差分吸收光谱，在这方面还有待进一步探究。 ( 参考文献： ) ( [1] PLATTU， PERNER D. D i re c tmeasurements of amospheric CHO， HNO，， O and SO， by differ e ntial absorp tion in t h enearUV[ J ]. G e ophys Res， 1 9 80， 85：7453-7458. ) ( [2] 谢品华，刘文清，郑朝晖，等.差分光学吸收光谱 (DOAS)技术在烟气 SO，监测中的应用[J]. ：光子学报，2000， 29(3)：271-2 7 6. ) ( [3] 董凤忠，刘文清，刘建国，等. 机动车尾气的道边在线实时监测(上)[J]. 测试技术学报，2005，19(3)： ： 1 19-127. ) ( PLATTU. Optical and l a ser remote s ensing[M]. N ew Y o rk： S p ringer-Verlag， 1983： 9 5 -105 . ) ( 14 PLATTU， PE R NER D. S i mu l taneous measurements of amospheric CHO， Os and NO， by d ifferential ab so i ption[J].Geophys Res， 1 979， 84： 6 329-6335. ) ( [6] 周斌，刘文清，齐峰，等.差分光学吸收光谱法测量大气污染气体的研究[J].环境科学研究，200114(5)： 23. ) ( 周晨赓.几种信号分析方法对非线性、非平稳信号分析效果的比较[J].电子技术应用，2003，4：43-45. ) ( 布雷斯韦尔罗纳德N.傅里叶变换及其应用[M].殷勤业，张建国，译.西安：西安交通大学出版社，2005： ： 10- 13. ) ( [9] DA SZYKOW SKIM， WALCZAK B. Use and abuse of chemometrics in chro m atography [J]. Trends in Analytical Chem is- try ， 2006，25： 1081-1096. ) ( [10] ELERSPHC A pe r fect smoother[J]. A nal Chem， 2003， 75： 3 631-3636. ) ( [11] KITAMURA K. HOZUMIK E ffect o fthe degree o f polynom ials in the Savitzky- Golay method for c alculation ofseco n d- derivative s pectra [ J ] . .1 Anal Chem， 1 985， ] 172：111-118 ) ( [12] 司福祺，刘建国，郑朝辉，等.差分光学吸收光谱系统中标准吸收界面数据处理方法研究[J].量子电子学报， 2002， 1 9(6)： 4 99-503. ) ( (上接第614页) ) ( [11] 孙国祥，周隽思，孙毓庆.毛细管区带电泳法测定甘草浸膏粉中甘草酸和甘草次酸的含量[J].解放军药学学 报，2003， 1 9： 10-12 ) ( [12] RAUCHENSTENERA F ， MATSUMURAA Y， YAMAMOTOA Y， et al Analysis and c omparison o f Radix Glycyrrhizae( l icorice) from Europe a nd China by cap illary- z one electrophoresis[J ] . . J J Chromatogr . A， 2005 ， 1081(1)：65 - 71. ) ( [13] RAUCHENSTE NER F， MATSUMURA Y， YAMA M OTO Y， et al Analysis a nd comparison of Radix Glycyrrhizae ( lico-rice) from E urope and China by cap illary- zone electrophoresis[J ] J J Phamaceutical and B iomedical Analysis，2005，38(4)：594-600. ) ( [14] 徐木生，王小如，杨 原. 非 水介质毛细管电泳[J].色谱，1998， 1 6(4 ) ：309-313. ) O China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net