儿茶中茶素、表儿茶素检测方案(毛细管电泳仪)

第22卷增刊2003年11月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.22SSuppl.2003-11 毛细管电泳安培检测法测定儿茶中的儿茶素，表儿茶素 袁倬斌*，李向军 (中国科学院研究生院，北京100039) 摘 要：用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件.以直径为50 pm的碳纤维微电极为工作电极，电极电位为 +1.2V (vs. Ag/AgCl)， 20mmol/L的 NazB，0，-H， BO， (pH值为 8.4)+80 mmol/L SDS 为缓冲溶液.在此条件下，儿茶素和表儿茶素在10 min 内得到了良好的分离。儿茶素和表儿茶素分别在5.0×10-3~0.5 mg/mL 浓度范围内与电泳峰电流呈现良好线性关系，检测下限分别为0.1 mg/mL 和 0.05 mg/mL。将之应用于实际样品的测定。 关键词：毛细管电泳；安培检测；儿茶素；表儿茶素 儿茶素属于黄烷醇类化合物，具有止泻、解毒、抗菌、抗病毒、抗癌及预防胃溃疡等作用，能有效降低毛细血管的通透性和脆性，广泛分布于银杏、沙枣、布麻、茶、儿茶等植物的组织中；表儿茶素是儿茶素的立体异构体，它能显著抑制胆碱酯酶，有抑制乳酸菌生成、降低大鼠血清和肝脏中胆固醇的作用，广泛分布于银杏、沙枣、茶、儿茶等植物中。儿茶素和表儿茶素都是儿茶的主要成分，儿茶是一种常见的中药，具有生津化痰，止血敛疮的功效，常被用于痰热咳嗽、咯血、口渴，溃疡久不收口、外伤出血等症状的治疗。毛细管电泳技术是一种近年来发展很快的分离分析技术，具有高效、快速、进样体积小和抗污染能力强等特点，有关其应用已多次做过综述报道。电化学检测，特别是安培检测，通过选择合适的检测电位和工作电极，具有比紫外检测更高的灵敏度，已被应用于中药有效成分的分离检测。而有关毛细管电泳安培检测法测定此类物质尚未见报道。毛细管电泳安培检测法具有检测灵敏度高、价廉的特点，本文以炭纤维微电极为工作电极，采用毛细管电泳柱上安培检测法同时测定了儿茶中的儿茶素和表儿茶素，效果较好。 实验部分 1.1 仪器和试剂 自组装毛细管电泳安培检测系统；ACS-2000安培检测器(中国科学院研究生院应用化学研究所)；CHI660 电化学系统(CH Instruments，U.S.A.)；未涂层带高压电场隔离接口弹性融硅毛细管柱(50pm ID，总长 42 cm，有效长度40 cm，河北永年光导纤维厂)；PH-HJ90B 型便携式酸度计(上海雷磁仪器厂)；电化学测量采用三电极系统，Ag/AgCI(饱和KCI)为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极(直径50um)为工作电极。 儿茶素(Catechin)、表儿茶素(Epicatechin)对照品(中国药品生物制品检定所)，儿茶(购于邦定药店)，其它试剂均为分析纯，试验用水为二次重蒸水 标准溶液的制备 分别准确秤取儿茶素和表儿茶素对照品适量用乙醇溶解，使浓度为2.0 mg/mL.以 0.45 pm 滤膜过滤后备用。 1.3 样品溶液的制备 取儿茶药材适量，粉碎后，过100目筛，精密称取儿茶粉末 10.0660 g，加入 50 mL乙醇，置于索氏提取器中，加热回流6h，过滤，滤液放人25 mL容 ( *基金项目：国家自然科学基金(20175025，29875027)，国家自然科学基金分析化学重点基金(20235010)，电分析化学国家重点实验室基金，“十五”国家重大科技攻关项目(2001BA210A04第七课题)资助项目 ) 量瓶中，乙醇稀释到刻度，放入冰箱中备用。 1.4 电极的制备及预处理 工作电极的制作参照文献进行，将直径约50pm 的一束炭纤维穿入内径250 um的毛细管内，并使得碳纤维伸出约0.5~1cm，再用环氧树脂将伸出碳纤维的管口封住，室温晾干。然后将毛细管穿入检测池的螺丝孔内，使其与分离毛细管在一条直线上，电极尖端插入分离毛细管口大约0.5 mm。 电极的预处理可分为两步进行，对于自制的碳纤维微电极，使用前首先用超声清洗之后，再将其固定在检测池上，然后，在-0.8~1.5V之间，以扫速100 mV/s 循环伏安扫描 2 min，活化电极。 1.5 试验条件的选择 以10 mmol/L Na B.O， 硼砂-10 mmol/L KH， PO -50 mmol/L SDS(pH 8.4)为电泳介质，未涂层弹性融硅毛细管(50 um ID，总长 42 cm，有效长度40 cm)。 所有溶液使用前均用0.45 um 滤膜过滤.实验前毛细管依次以0.10 mol/L NaOH溶液、蒸馏水及电泳液各清洗3 min，电动进样5s，每次电泳后用电泳介质清洗2 min，然后进行分离则定，分离电压20kV，检测电位0.8V，测定峰电流的高度.所有实验均在室温下进行。 2结果与讨论 2.1 儿茶素和表儿茶素的循环伏安图及动态伏安图 由儿茶素和表儿茶素的循环伏安图可以看出：与空白溶液相比，儿茶素、表儿茶素的氧化电流明显增大，在0.5~0.8V之间，均有氧化峰出现，其中儿茶素的氧化电流最大。由儿茶素和表儿茶素的动态伏安图可以看出，随着检测电位的增加，儿茶素和表儿茶素的氧化电流增大，当检测电位大于0.7V时，儿茶素和表儿茶素的氧化电流急剧增加，但由于随着检测电位的增加，基体噪声也随着增大，实验中我们选择1.0V为检测电位，在此电位下，不仅基体电流较小，信噪比也较大。 2.2 电泳分离条件 文献报道硼砂可与多羟基化合物形成有利于分离的络合物，因此，我们选择硼砂溶液作为电泳缓冲溶液。电泳液的 pH值及浓度对分离效果有着很大的影响，在溶液中，溶液的 pH 值对毛细管的表面特性及被分离样品的有效电荷有直接的影响，缓冲溶液pH的调节与控制是优化分离的重要对策。本文分别考察了不同浓度和 pH 值的电泳 缓冲溶液对儿茶素和表儿茶素迁移时间的影响。实验中发现：随缓冲溶液 pH值的增加，迁移时间增加，两种物质中，儿茶素的分离时间较短，当 pH值为8.8时，分离效果较好，因此，试验过程中选择最佳 pH 值为8.8，电泳缓冲液浓度为40 mmol/L。 表面活性剂的加入不仅可以改变被分离物质的分离效果，而且可以增加疏水性物质在缓冲溶液中的溶解度。对于常见的十二烷基硫酸钠(SDS)胶束，因其表面带负电荷，荷动方向与 EOF 相反，向阳极方向泳动，虽然在电渗流的作用下，其实际移动方向和 EOF 相同，都向阴极移动，但移动速度要小于EOF 的移动速度，因此，那些与胶束作用比较强的疏水性物质的移动速度要小于疏水性较弱的物质。为获得最佳的分离效果，考察了 SDS(0~50 mM)浓度对儿茶素和表儿茶素分离效果的影响，随 SDS 浓度增加，儿茶素和表儿茶素的迁移时间都有所增加，当 SDS 浓度大于80mM时，分离效果较好，为获得较好的分离效果和较多的分离时间，实验过程中选择 SDS 浓度为 80 mM。 有机溶剂作为一种改性剂，常常加到缓冲溶液中，以改变缓冲溶液性能，来分离一些在水溶液中不能分离的峰。为此，我们考察了甲醇对儿茶素和表儿茶素分离度的影响，发现随着甲醇浓度的增加，迁移时间变长，尽管分离度变化不明显，但检测峰的峰型变好，因此，实验过程中选择甲醇浓度为10%(V/V)。 2.3 工作曲线及检测限 在上述最佳实验条件下，儿茶素和表儿茶素得到了良好分离。对一系列儿茶素和表儿茶素的标准混合样品进行分析测定，测定其峰电流与浓度的关系，所得儿茶素和表儿茶素的线性范围、相关系数及检测限分别为：0.05~1.0 mg/mL， 0.9900 和0.02 mg/mL 和0.05~2.0 mg/mL， 0.9922和0.01mg/mL. 2.4 样品测定及回收率 在上述最佳实验条件下，分离测定了儿茶中儿茶素、表儿茶素的含量。测得儿茶中儿茶素、表儿茶素的含量分别为 126.56 mg/g和21.9 mg/g，回收率分别为98.1%和96.0%。 3结论 用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量，研究了各种实验条 件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件.在此条件下，儿茶素和表儿茶素在10 min 内得到了良好的分离。将之应用于实际样品的测定。 Determination of catechin and epicatechin inChinese herbal drugs by capillary electrophoresiswith electrochemical detection YUAN Zhuo-bin and LI.Xiang-jun (Department of Chemistry， Graduate School，Chinese Academy of Science， Beijing 100039)Abstract： Capillary electrophoresis with amperometricdetection is evaluated for the simultaneous determinationof Catechin and Epicatechin. The cyclic voltammogram，hydrodynamic voltammogram， effect of pH， concentra- tion of buffer and SDS， percentage of organic modifer onthe separation and the detection were studied. The con-dition were optimized as follows： 1.2 V detection poten-tial， 20 mM borate buffer at pH8.4， 80 mM SDS and10% acetontrile. The method provideed low detectionlimit as 0.001 mg/mL and 0.0005 mg/mL， wide linearranger 0.005 ~0.5 mg/mL and 0.005~0.5 mg/mL forCatechin and Epicatechin， respectively. In addition，the levels of two compounds in traditional Chinese herbaldrugs were easily determined. Keywords： Catechin； Epicatechin； Capillary electro-phoresis ..数据 -数据