Labsolutions MD用于寡核苷酸及其相关杂质的分析方法开发

在寡核苷酸的分析中，分离度随着添加到流动相中的HFIP以及离子对试剂的浓度、有机溶剂成分、柱温箱温度以及梯度程序等各种LC参数的不同而发生变化。另外，变化的行为取决于寡核苷酸链长、碱基组成和修饰键的有无等，因此，需要针对每个目标序列分别进行分离优化。另一方面，针对各目标序列分别进行全面分析，解析所获得的庞大的数据，搜索最佳条件都需要耗费大量的工作量。使用LabSolutions MD时，可自动创建实验设计和制备流动相，另外，在分析方面，可实现峰追踪的自动化，通过设计空间高效地搜索最佳条件。如本文的所示，通过LabSolutionsMD与惰性UHPLC系统NexeraXSinert、Shim-packScepterClaris（惰性柱）、单四极杆质谱仪LCMS-2050的组合，可以提高寡核苷酸分析方法开发工作流程的效率。 Application News HPLC 分析方法开发辅助软件 LabSolutionsTMMD Labsolutions MD 用于寡核苷酸及其相关 杂质的分析方法开发 01-00558-CN 藤崎真一、铃木里沙 特点描述 ◆通过 LabSolutions MD 可以提高寡核苷酸和相关杂质最佳分离条件的方法开发工作效率。 ◆寡核苷酸和相关杂质峰可以通过单四极杆质谱仪 LCMSTM-2050 进行正确追踪。 ◆惰性 UHPLC 系统 NexeraTMXS inert、 Shim-pack ScepterTMClaris (惰性柱)可抑制寡核苷酸的金属配位吸附，并获得良好的峰形。 ■简介 以反义寡核苷酸等为代表的核酸药物通过作用于细胞内外的 靶点(基因、蛋白等)发挥药效。核酸药物是通过化学合成生产的，但在其合成过程中会引入错误长度的产物以及保护基团等多种 杂质，因此，如何正确分离含有杂质的大量寡核苷酸是一大挑 战。LC分析中，反相离子对色谱法(RP-IP)是一种分离带有电 荷的物质时常用的分离模式。在RP-IP中，分离模式会随着流动 相的离子对试剂添加浓度以及有机溶剂成分的不同而发生变化，但是，变化的模式取决于寡核苷酸链长、碱基组成和修饰键的 有无等，因此，针对每个目标序列分别进行分离优化尤为重要。本文介绍使用分析方法开发辅助软件 LabSolutions MD， 针对具 有不同链长和修饰键的寡核苷酸及相关杂质，分别通过筛选和 优化阶段，高效地实现寡核昔酸和相关杂质的最佳分离。 ■样品信息 作为测定样品使用的寡核苷酸序列(共6种)如表1所示。将全长的产物(FLP)以及 3'端、5'端缺失1个或3个碱基的 n-1(3')、n-1(5')和 n-3的缺失体、或添加1个碱基的 n+1加合 体、5'端的由硫代磷酸酯修饰为磷酸二酯键的 PS → PO突变体 的5种杂质，共计6种物质的混合样品作为合成反义寡核苷酸 的模型样品使用。 表1 目标分析样品 名称 序列(5'→3') 长度 FLP T*-mC*-T*-T*-G*-dG-dT-dT-dA-dC-dA-dT-dG-dA-dA-A*-T*-mC*-mC*-mC* 20 mer n-1(3') T*-mC*-T*-T*-G*-dG-dT-dT-dA-dC-dA-dT-dG-dA-dA-A*-T*-mC*-mC* 19 mer n-1(5') mC*-T*-T*-G*-dG-dT-dT-dA-dC-dA-dT-dG-dA-dA-A*-T*-mC*-mC*-mC* 19 mer n-3 T*-G*-dG-dT-dT-dA-dC-dA-dT-dG-dA-dA-A*-T*-mC*-mC*-mC* 17 mer n+1 T*-T*-mC*-T*-T*-G*-dG-dT-dT-dA-dC-dA-dT-dG-dA-dA-A*-T*-mC*-mC*-mC* 21 mer PO FLP 5' 端的 PS→PO变化体 20 mer 备注： *=2'-O-methoxyethyl， m=5-methyl， d=2'-deoxy， PS(full) ■流动相的筛选 筛选阶段(分析条件：表2)中主要考察对保留和分离造成重 大影响的参数，研究了水相流动相中的 HFIP以及离子对试剂(三 乙胺： TEA)的添加浓度、有机流动相中的乙腈和甲醇混合比例。具体来说，将 HFIP的添加浓度设为 100、200 mmol/L(2种水平)、TEA 的添加浓度设为5、10、15、20 mmol/L (4种水平)、有机 流动机中的乙腈比例设为0、50、100%(3种水平)，共创建了 24(2×4×3)种实验设计，以预测最佳的组合。LabSolutions MD可以按照流动相和色谱柱等各种参数组合自动生成(图1的 ①~⑤的步骤)实验设计，不会出现失误。此外，使用流动相混 合功能，可以自动制备含不同 HFIP 和 TEA 添加浓度以及有机溶 剂比例的流动相。通过点击选择所使用的流动相(图1的①)，即可按照所选择的添加浓度和有机溶剂比例自动制备流动相，因 此，不仅可以大幅减少手动制备的负担，还能防止出现制备失误。 图1 实验设计创建画面 筛选条件 表2 系统 ： Nexera XS 生物惰性系统(方法开发系统) 色谱柱 ： Shim-pack Scepter Claris (100 mm ×2.1 mm I.D.， 3 um， P/N： 227-31210- 05*)* 岛津 GLC 产品编号 柱温 ： 60°C 进样量 ： 2uL 流动相 泵A-流路A ： 100 mmol/L HFIP”和 20 mmol/L TEA”水溶液 -流路B ： 100 mmol/L HFIP 水溶液 -流路C ： 200 mmol/L HFIP 和 20 mmol/L TEA 水溶液 -流路D ： 200 mmol/L HFIP 水溶液 泵B-流路A ： 乙腈 -流路B ： 甲醇 流速 ： 0.4mL/min 时间程序(%B) ： 6%(0min)→24% (36 min)→50%(36-37 min)→6% (37-46 min) 检测 ： 260nm (SPD-M40， UHPLC 惰性池) 系统 ： LCMS-2050 离子化模式 ： ESI/APCI (DUISTM)，负离子模式 扫描模式 ： SCAN (m/z 500-2000) 雾化气流速 ： 2.0 L/min (N2) 干燥气流速 ： 5.0 L/min (N2) 加热气流速 ： 7.0 L/min (N2) DL 温度 ： 200℃ 脱溶剂温度 ： 450℃ 接口电压 ： -2.0kV *1 1，1，1，3.3.3-六氟-2-丙醇 *2三乙胺 流动相的筛选结果 通过改变水相中的 HFIP 和 TEA 添加浓度、有机相中的乙腈 和甲醇的混合比例形成的24种分析条件的色谱图 (FLP和各杂 质，共6种)如图2所示。 图2 通过流动相的筛选获得的色谱图 HFIP 添加浓度 100 mmol/L(上)、200 mmol/L(下) 由于 HFIP 和 TEA 的添加浓度以及有机溶剂成分不同，可以发现 FLP和各杂质的保留和分离会发生很大变化。另外，在 HFIP 为 200 mmol/L、乙腈为100%的条件(图2中的③、16、①9、②)下，观察到了基线的变化。这可能会对各样品的峰形以及定量造 成影响。 ■通过筛选结果快速预测最佳流动相 条件 为了在筛选中获得与研究的条件数量一致的色谱图，需要对 各个分析条件获得目标物的分离效果进行评估，但这项工作需 要具有色谱法相关知识和经验，而且十分耗时。LabSolutions MD 可以使用如下的公式1对各条件下的分离状态进行定量评 估和排序，不依赖分析人员的感觉和经验，任何人都可以快速、轻松地预测最佳条件。 评价值可通过峰检测数(P)和分离度(Rs)总和的乘积进行 计算。将筛选阶段中得到的评价值按照从高到低的顺序表示，结果如图3所示。HFIP的添加浓度为100 mmol/L、TEA 的添加 浓度为 10 mmol/L、有机流动相使用乙腈/甲醇=50：50时获得 最高的评价值，为FLP和各种杂质分离的最佳流动相条件(图 2中⑤的色谱图、该色谱图在图4中放大显示)。另外，在各 杂质中， n-1(5')和 n-1(3')的分离度最小，推测这是因为n-1(5')和n-1(3')的链长相同，结构类似。 然后，在优化阶段，研究了柱温箱温度、梯度程序等各种LC 参数的最佳水平，预测了进一步改进分离度，具有更高稳定性 的条件。 图3 各条件通过评价值排序 (按照评价值从高到低的顺序显示前10的条件) 图4 评价值最高的色谱图 ■各种LC 参数的优化 针对在筛选过程中获得了最佳分离的水相及有机相，将有机 流动相中的乙腈比例在40、50、60%(3种水平)中变化，柱 温箱温度在55、60、65℃(3种水平)中变化，梯度初始浓度 在6、7、8%(3种水平)中变化，优化了 FLP 和各杂质的分离。获得的色谱图如图5~7所示。从中观察到，有机流动相中的乙 腈比例越高、柱温箱温度越高、梯度初始浓度越高，则各峰的 分离度越高的趋势。 然后对 FLP 和各杂质进行峰值追踪，以实现分离度在设计空 间中的全面可视化。 ■杂质峰的 MS 追踪 在柱温箱温度为60℃、梯度初始浓度为8%、有机流动相中 的乙腈比例为50%和60%的条件下获得的 LC 色谱图以及各杂 质 MS 光谱的基峰m/z如图8所示，各杂质的 UV光谱如图9所 示。结果表明，在寡核苷酸的杂质中， n-3、n-1(5')、n-1(3')、PO、n+1 的 UV光谱非常类似，相似度均为0.99以上，通过 UV 光谱进行追踪非常困难。另一方面， LabSolutions MD 可以依据 LCMS-2050 的质谱信息进行峰追踪，因此，针对UV光谱类似的 有关物质，也能进行准确地鉴定(图8)。 10 12 14 16 18 min 图8 柱温箱温度60℃、初始浓度8%、 乙腈比例50%(上)及60%(下)的 LC色谱图 *虚线表面通过质谱信息追踪有关物质 图9 寡核苷酸的杂质的UV光谱 本研究追踪寡核苷酸的杂质时使用了通过LCMS-2050 获得的 质谱信息， LabSolutions MD 除质谱信息之外，还可以使用 UV光 谱相似度、面积值等的任意参数准确追踪分析对象的峰。即使因 为分析条件的变更导致峰洗脱位置发生变化的情况下，也可以针 对全部数据自动识别峰，大幅缩短鉴定所需的工作量(图10)。只需从下拉列表中选择用于追踪的项目(图10中的红框内)，即可轻松对所有数据进行峰追踪。 图10 LabSolutions MD 的峰追踪设置画面 然后，通过设计空间对 FLP及各杂质的分离度进行可视化，预 测了具有良好的分离度和高稳定性的最佳分离条件。 ■通过设计空间预测最佳分析条件 将有机相中的乙腈比例、柱温箱温度与 FLP和各杂质分离度的 设计空间如图11所示。图中的红色区域表示分离度大、蓝色区 域表示分离度小的区域。通过设计空间的绘制可知，柱温箱温度 越高，分离效果越好，而乙腈的最佳配比与化合物有关。 图11 FLP 和各杂质的分离度的设计空间 *梯度初始浓度为8% LabSolutions MD 通过重叠绘制多个设计空间，可以自动预测 满足多个标准的最佳条件。例如，将最难分离的n-1(5')和n-1(3')的分离度最大、第2难分离的n-1(3')和 PO的分离度为0.7以 上、最终峰(n+1) 的保留时间16分钟以下作为标准，通过重叠 绘制满足上述标准的条件区域进行预测，确认最佳分析条件(图 12)。图12的绿线内的区域表示n-1(3')和 PO 的分离度小于0.7的区域，橙线内表示最终峰的保留时间大于16分钟的区域，剩 下的区域用黑线阴影表示，红色圆圈内的点A是n-1(5')和n-1(3')的分离度最大的条件(乙腈比例54%、柱温箱温度65℃、初始 浓度8%)。通过叠加最后一个洗脱峰的出峰时间和最小分离度 的设计空间，可以很容易地找到同时满足分离度和更短分析时间 的最佳条件。 图12 通过重叠绘制设计空间预测最佳条件 ■最佳分离条件下的色谱图 通过设计空间预测的最佳条件(点A)下的色谱图如图13所 示。n-1(3')和 PO的分离度为0.7以上、最终峰(n+1)的保留 时间在16分钟以内，并考虑到缩短分析时间，完成了对分离的 优化。虽然 n-1(5')和 n-1(3') 的链长相同，结构类似，但可通过 设计空间将分离度进行全面可视化，无需依靠分析人员的感觉 和经验即可进行分离优化。 图13优化条件下的色谱图 HFIP 的添加浓度100 mmol/L、TEA的添加浓度 10 mmol/L 结论 在寡核苷酸的分析中，分离度随着添加到流动相中的 HFIP以 及离子对试剂的浓度、有机溶剂成分、柱温箱温度以及梯度程序 等各种LC 参数的不同而发生变化。另外，变化的行为取决于寡 核苷酸链长、碱基组成和修饰键的有无等，因此，需要针对每 个目标序列分别进行分离优化。另一方面，针对各目标序列分 别进行全面分析，解析所获得的庞大的数据，预测最佳条件都 需要耗费大量的工作量。使用 LabSolutions MD时， 可自动创建 实验设计和制备流动相，另外，在分析方面，可实现峰追踪的 自动化，通过设计空间高效地预测最佳条件。如本文的所示，通过 LabSolutionsMD 与惰性 UHPLC 系统 NexeraXSinert、Shim-packScepterClaris (惰性柱)、单四极杆质谱仪LCMS-2050 的组合，可以提高寡核苷酸分析方法开发工作流程的效率。 致谢 本应用新闻获得了旨在实现AMED 下一代治疗和诊断的原研 药基础技术开发事业“核酸药物的生产、纯化、分析基础技术的 开发”项目(代表：小比贺聪)的大力支持。 http：//www.shimadzu.com.cn 用户服务热线电话： 800-810-0439 免责声明： *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。