使用LabSolutions Insight™ Biologics进行寡核苷酸杂质分析的工作流程

使用LabSolutions Insight Biologics软件可以对寡核苷酸的杂质进行全面鉴定和序列确认。不仅主要成分得到了完整的序列覆盖，丰度比0.5%的杂质也能得到很高的序列覆盖度。News ApplicationNews Application News 液相色谱质谱仪 LCMSTM-9050 使用 LabSolutions InsightTM Biologics 进 行寡核苷酸杂质分析的工作流程 01-00595-CN 加藤纪子、中园纯菜 特点描述 ◆使用 LabSolutions Insight Biologics 软件，可通过简单的工作流程进行寡核苷酸和杂质的特性评价。 ◆可以进行寡核苷酸杂质的同时鉴定。 ◆通过片段覆盖度界面，缺失位置和修饰位置一目了然。 ■简介 近年来，核酸药物飞速发展，作为一种新的药物发现方 式受到了广泛关注。但是，为了确认作为药物的安全性和有 效性，需要对杂质进行全面检测和鉴定。本文中介绍了利用 四极杆飞行时间质谱仪 LCMS-9050 和 LabSolutions Insight Biologics 进行杂质分析的工作流程。 ■样品 测定用序列是 CTGCTAGCCTCTGGATTTGA、为经硫代磷酸修 饰的 20-mer 寡核苷酸粗品(以下称：粗品PS20mer)。 ■分析条件 测定仪器使用 NexeraTMXS inert 和 LCMS-9050，使用了 Data Dependent Acquisition(DDA)模式。LC条件如表1所示， MS 条件如表2所示。 [HPLC条件](NexeraXS 生物惰性系统) 色谱柱 ：Shim-pack ScepterTM Claris C18-120， 50 mm × 2.1 mm I.D.， 1.9 um 流动相 ：A) 含 100 mM HFIP/10 mM TEA的水溶液 B) 含 50 mM HFIP/5 mM TEA 的50%甲醇 梯度程序 时间(min) 流量 (mL/min) A浓度 B浓度 0.00 0.3 95 5 1.00 0.3 95 5 26.00 0.3 60 40 26.10 0.3 10 90 30.00 0.3 10 90 30.10 0.3 95 5 34.00 0.3 95 5 柱温 ：60°℃ 进样量 ：2pL *1： P/N 227-31210-02 表2MS条件 [MS 的条件] (LCMS-9050) 离子化 ：ESI(负离子模式) 模式 ：MS扫描 (m/z550~2500)， DDA 接口电压 ： -3.0kV 雾化气流量 ： 3.0 L/min 干燥气流量 ： 10.0 L/min 加热气体流量 ： 10.0 L/min DL 温度 ： 250℃ 加热器温度 ： 400°℃ 接口温度 ： 350℃ ■分析参数设置 LabSolutions Insight Biologics 是用于寡核苷酸及其杂质特 性评价的分析软件。首先，在参数设置界面中选择事先注册 的核碱基、连接子、核糖、碱基修饰等来创建序列。上述核 碱基、连接子、核糖、碱基修饰可自由追加和编辑。输入序 列后显示分子式和单同位素质量，右侧显示结构式(图1)。可实时显示所输入序列的结构式，直观确认输入错误。 如图2所示，为了方便查看，不同核碱基部分以不同颜色 显示，而且还可以显示碎片位置。 图1参数设置画面 图2 显示片段部分 在目标修饰的选项卡中选择预期的杂质。除链长差异、核 碱基缺失、脱嘌呤/嘧啶、脱氨基、保护残基等的杂质、加 合离子和未知修饰体之外，还可以对用户添加的分子变化进 行搜索设置。 ■分析结果 粗品 PS20mer 通过 PDA 和 MS进行检测。各色谱图如图 3所示。LC色谱图和MS色谱图可以上下显示，进行峰值确认。 MS 色谱图显示为组分色谱图，该色谱图基于 MS1质谱，并组合不同电荷数和同位素峰的质谱信号。PS20mer 的多电 荷离子质谱图和解卷积质谱图如图4所示。 寡核苷酸杂质的质谱图也被解卷积，用于杂质的检索。 根据 MS1 数据对杂质进行了详细的搜索，共鉴定出不同 链长、碱基缺失体、离子加合物等30余种杂质。 图3 粗品 PS20mer 的UV色谱图(上)和组分色谱图(下) 330 FLP(C1：A20) 24.546 6399.61670Mono-isotopic 1.00 1.00 ---- U31 FLP(C1：A20)[-H+Nal 24.546 6425.60010|Most Abundant 0.65 0.94 5.182 图4 PS20mer 的质谱图(下)和解卷积质谱图(上) 序列覆盖度显示有两种模式，填充模式可查看分配离子的 强度信息和全面性，分支模式可显示碎片序列，可以根据需 要确认的项目进行切换。 此外，该软件可基于 MS2 的碎片离子显示序列覆盖度。碎片离子在 PS20mer 序列中的分配结果如图5、6所示。每个核碱基处碎裂生成的碎片离子，与序列保持一致。 图5 PS20mer 序列覆盖度(填充模式) 图6 PS20mer 序列覆盖度(分支模式) ■确认杂质的序列 从5'端缺失14个核苷酸的杂质(下称N-14)的序列，其相对于主成分的丰度比为0.5%。如通过图7确认的核碱 基上部的绿色√标志所示，通过高覆盖度证实了分析结果的 可靠性。 图7 N-14的序列覆盖率 ■结论 使用 LabSolutions Insight Biologics 软件可以对寡核苷酸的杂 质进行全面鉴定和序列确认。 不仅主要成分得到了完整的序列覆盖，丰度比0.5%的杂质 也能得到很高的序列覆盖度。 岛津应用云 <致谢> 在本文中介绍的测定样品是由 PeptiStar 株式会社提供的。对该公司的协助深表感谢。 LCMS、LabSolutions Insight、Nexera 和 Shim-pack Scepter 是岛津制作所株式会社或其相关公司在日本及 其他国家/地区的商标。 免责声明： 用户服务热线电话： 800-810-0439 *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。