阿达木单抗中聚集体检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA19-162Excellence in Science Excellence in ScienceLC-187 田|岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 Nexera Bio 液相色谱系统用于阿达木单抗的聚集体分析 LC-187 摘要：本文使用尺寸排阻色谱((SEC) 进行单克隆抗本体(mAb)聚集体分析，采用色谱柱为 Shim-pack BioDiol-200，流动相为150 mmol/L磷酸钠缓冲液和150 mmol/L氯化钠溶液的流动相条件进行分析，二聚体和单体分离度为2.232，色谱分离良好。重复性结果显示，二聚体和单体的保留时间和峰面积的 RSD%均小于0.5%，重复性良好。实验数据表明 Nexera Bio 液相色谱系统和 Shim-pack Bio SEC 色谱柱在 SEC 分析中，可以提供良好色谱峰型，带来快速有效分离，保证稳定可靠分析。 关键词： Nexera Bio HPLC Shim-pack Bio mAb 聚集体 SEC 单克隆抗体(mAb)是一类单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。0一般通过杂交瘤技术或基因工程技术构建细胞株，经过细胞培养代谢、纯化等工艺步骤制备产生。 核心将不同单体聚集在一起，进而形成为聚集体。单抗的聚集体会影响其作为治疗药物的安全性和有效性，聚集体不仅会降低药物的效果，还会引起机体的免疫反应，具有潜在的副作用。故在 mAb 研发、生产过程中需对其聚集体进行严格监控。 mAb 生生产、储存、运输过程中都会伴随聚集体的形成，这种聚集体的形成多由单抗氨基酸序列的错误折叠、不完全折叠造成“hot spots”的暴露， “hotspots”一般为氨基酸序列，具有高度疏水性、低电荷性且易形成β-折叠等特性，接着以“hot spots”为 尺寸排阻色谱(SEC) 是mAb 聚集体分析常用的一种分析方法。此应用利用 Nexera Bio 生物惰性液相系统和 Shim-pack Bio Diol-200 生物惰性色谱柱进行SEC测试，用于阿达木单抗的聚集体分析。 I实验部分 1.1仪器 岛津 Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统。具体配置为： DGU-20A3在线脱气机， LC-20ADXR Bio 输液泵，SIL-20A XR Bio 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 图1 Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统硬件示意图 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack Bio Diol-200(4.6mm l.D.× 300 mm L.， 3um) 流动相：含150 mmol/L磷酸钠和 150 mmol/L 氯化钠的水溶液((pH=6.8) 流速：0.5mL/min 柱温：30℃ 进样量： 5pL 波长：214nm 洗脱方式：等度洗脱 1.3样品制备 1.3.1标准工作溶液配制 取适量阿达木单抗储备母液，用超纯水配制成浓度为 2.5 mg/mL 的工作溶液。 I结果讨论 2.1 Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统 Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统泵头采用惰性碳材料包覆，能够有效抵御高盐非挥发性缓冲盐腐蚀，延长使用寿命；不锈钢包覆的 PEEK管路，提高系统耐压值；管路结合处利用金的优良延展性，让管路接合更紧密，避免微量漏液；高韧性和强度的化学惰性陶瓷针避免金属接触，降低样品非特异性表面作用。此生物惰性液相色谱系统能够显著提高生物大分子分析的耐用性和性能，保证分析的良好重现性，并极大降低高盐流动性体系的维护成本，为尺寸排阻色谱分析提供良好分析条件。 图2 Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统 2.2分离度考察 采用 Shim-pack Bio Diol-200 色谱柱，流动相为150 mmol/L 磷酸钠缓冲液和 150 mmol/L 氯化钠溶液的流动相条件进行分离度考察，从表1中可以看出，二聚体和单体分离度为2.232，分离效果良好，达到基线分离。拖尾因子为1.015，色谱峰型匀称、尖锐。表明 Shim-pack Bio Diol-200 色谱柱能够提供良好色谱分离效果，以及降低生物样品非特异性表面作用，保证良好色谱峰型。 图3分离度考察色谱图 2.3重复性 将单抗工作溶液按上述分析条件进行重复测定6次，进行重复性考察。 从图4中可以看出二聚体与单体的分离度良好，在7min之内即可快速洗脱出来， 表明 Shim-pack Bio 色谱柱在保证分离效果的基础上，减少分析时间，提高分析通量。从表1中看出，重复进样6次测试，二聚体和单体的保留时间和峰面积的 RSD% 均小于0.5%，表明分析方法重复性良好、Nexera Bio 生物惰性液相色谱系统稳定可靠。 图4mAb二聚体和单体的保留时间和峰面积(n=6)多次进样测试结果 表1重复性结果 二聚体 单体 RT(min) Area RT(min) Area Injection-1 4.142 613，148 4.857 24，851，784 Injection-2 4.142 617，394 4.856 24，976，957 Injection-3 4.135 618，005 4.849 24，993，118 Injection-4 4.132 618，310 4.845 25，016，533 Injection-5 4.133 617，998 4.847 25，009，431 Injection-6 4.138 614，078 4.852 24，824，758 Average 4.137 616，489 4.851 24，945，430 RSD% 0.11 0.37 0.10 0.34 ■结论 本实验针对 SEC分析 mAb 进行分析测试。结果表明在确定分析条件下，二聚体和单体分离度良好，且重复性结果良好，系统稳定可靠。在 Nexera Bio 生物惰性液相色谱下，能够有效避免高盐流动相及蛋白质易吸附等对分析结果稳定性的影响，同时配合 Shim-pack Bio 专用色谱柱，可以保证快速、高效、稳定分析，从而满足单克隆抗体药物质量控制中 SEC分析的需求。 Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 本文使用尺寸排阻色谱（SEC）进行单克隆抗体（mAb）聚集体分析，采用色谱柱为Shim-pack Bio Diol-200，流动相为150 mmol/L磷酸钠缓冲液和150 mmol/L氯化钠溶液的流动相条件进行分析，二聚体和单体分离度为2.232，色谱分离良好。重复性结果显示，二聚体和单体的保留时间和峰面积的RSD%均小于0.5%，重复性良好。实验数据表明Nexera Bio液相色谱系统和Shim-pack Bio SEC色谱柱在SEC分析中，可以提供良好色谱峰型，带来快速有效分离，保证稳定可靠分析。