甲磺酸伊马替尼中芳香胺类遗传毒性杂质检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-136Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-412 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center上海市徐汇区宜州路180号B2栋http：//www.shimadzu.com.cn咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 LCMS-8060 液质联用系统测定甲磺酸伊马替尼中芳香胺类遗传毒性杂质含量 LCMSMS-412 摘要：本文建立了岛津三重四重杆液相色谱质谱联用仪 LCMS-8060 测定甲磺酸伊马替尼中潜在芳香胺类遗传毒性杂质2-甲基-5-硝基苯胺含量的方法。2-甲基-5-硝基苯胺在 5~60 ng/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r 值在0.999以上，且精密度实验结果良好，低中高浓度加标回收率在94.1%~95.7%。该方法简单、快速、且灵敏度和准确度高，实用性强，可用于甲磺酸伊马替尼中2-甲基-5-硝基苯胺遗传毒性杂质的检测。 关键词：三重四极杆质谱甲磺酸伊马替尼遗传毒性杂质 甲磺酸伊马替尼是瑞士诺华制药公司研发的 Bcr-Ab1酪氨酸激酶受体抑制剂，属苯胺喹唑啉类化合物，商品名为格列卫。该药物通过抑制酪氨酸激酶来有效治疗胃肠基质肿瘤和慢性骨髓性白血病，是世界上第一个分子靶向治疗药物。 遗传毒性杂质 (Genotoxic Impurities， GTIs)是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其它类型的无致突变性杂质，其主要来源于原料药的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、中间体、副产物、降解产物等。欧洲药品管理局(EMA)， 人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)和美国食品与药品 监督管理局(FDA)都出台了相应的遗传毒性杂质的指导原则要求。近期，中国国家药典委员会发布了关于《中国药典》2020年版四部通则增修订内容的公示，其中包括了“遗传毒性杂质控制指导原则审核稿”，遗传毒性杂质的研究变得越来越重要。 本文使用岛津LCMS-8060三重四极杆液质联用系统，建立了测定甲磺酸伊马替尼中潜在芳香胺类遗传毒性杂质2-甲基-5-硝基苯胺含量的方法。此方法灵敏度高，检测时间短，结果准确，可供甲磺酸伊马替尼质量控制参考。 I实验部分 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵， DGU-20A在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC柱温箱，二极管阵列检测器(PDA)， CBM-20A系统控制器，流路切换阀 FCV-20AH2， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： SHIMADZU Shim-pack GIST C18 (2.1×100 mm L.，2 um) 流动相：A相-0.1%甲酸水；B相-0.1%甲酸甲醇 等度洗脱： A/B=45/55(v/v) 流速：0.30mL/min 进样体积：10uL 质谱条件 离子源： ESI， 正离子模式 脱溶剂管温度：250℃ 离子源接口电压： 4.0kV 加热模块温度：450℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10 L/min MRM参数：见表1 碰撞气：氩气 驻留时间：80ms 表1MRM参数 化合物名称 CAS No. 监测离子对 Q1 pre (V) CE Q3Pre (V) 2-甲基-5-硝基苯胺 99-55-8 153.0>107.1* -30 -20 -10 153.0>89.1 -30 -33 -16 甲磺酸伊马替尼 220127-57-1 494.0>394.1* -12 -28 -28 494.0>217.1 -12 -25 -14 注：*表示定量离子对 1.3样品前处理 对照品溶液：取2-甲基-5-硝基苯胺对照品适量，精密称定，加入30%甲醇水溶液(v/v) 溶解并稀释成5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL 不同浓度的对照品溶液。 供试品溶液：取甲磺酸伊马替尼供试品大约500 mg， 精密称定，置于10mL容量瓶中，加入30%甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。 ■结果与讨论 2.1分析流路优化 遗传毒性杂质在主药中含量很低，为了确保遗传毒性杂质具有足够的响应，不宜对主药稀释太多。为避免一次进样中大量的主药对 LC-MS/MS 系统造成污染，可在分析过程中使用流路切换阀FCV-20AH2， 设置MS时间程序切除主药，只需将待测杂质引入质谱进行分析。同时，实现系统自动化分析，确保数据可靠，重复性好。本实验中， LC系统配置PDA检测器，可根据主药的出峰位置(见图1)确定切阀时间。使用 FCV-20AH， 在 3.2 min后将 LC 洗脱组分切入质谱，进行 LC-MS/MS分析。 图1甲磺酸伊马替尼样品 HPLC色谱图(268nm) 2.2方法专属性实验 在1.2分析条件下，对空白溶剂(30%甲醇水溶液)和2-甲基-5-硝基苯胺对照品溶液(30 ng/mL)进行检测，考察方法的专属性，色谱图见图2和图3。结果表明，在上述分析条件下，空白溶液不干扰2-甲基-5-硝基苯胺杂质的检测，专属性良好。 图2空白溶剂MRM 色谱图 图33：遗传毒性杂杂2-甲基-5-硝基苯胺的 MRM图谱 2.3标准曲线和检出限 将不同浓度2-甲基-5-硝基苯胺的对照品溶液按1.2中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图4所示；所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表2。 图42-甲基-5-硝基苯胺的标准曲线 表2标准曲线与检出限信息 化合物 校准曲线 r 线性范围 准确度 定量限 检出限 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) 2-甲基-5-硝基苯胺 Y=(9307.32)X+(1616.36) 0.9995 5~60 91.7-103.1% 5 1.6 2.4精密度实验 精密量取浓度为 15 ng/mL的2-甲基-5-硝基苯胺对照品溶液10 uL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图和峰面积，见图5。2-甲基-5-硝基苯胺保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD) 分别为 0.13%和2.85%。结果表明，本品连续进样精密度良好。 图5对照品连续6次进样图谱 2.5回收率实验 取甲磺酸伊马替尼供试品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加入30%甲醇水溶液溶解，并加入适量2-甲基-5-硝基苯胺对照品，配制成低中高三个不同浓度水平的加标样品。将加标样品上机分析，计算回收率结果如表3。 表3加标回收率结果(n=3) No. 加标浓度(ug/g) 回收率(%) 1 0.3 95.7 2 0.6 94.1 3 0.9 95.5 2.6实际样品分析结果 按照上述试验条件，对甲磺酸伊马替尼供试品中遗传毒性杂质2-甲基-5-硝基苯胺进行检测(见图6)，计算供试品中2-甲基-5-硝基苯胺的含量为 0.15 ug/g。根据《中国药典》2020年版四部通则增修订内容关于遗传毒性杂质控制的指导原则和甲磺酸伊马替尼成人最高日服用量800 mg计算，杂质2-甲基-5-硝基苯胺含量不应超出1.875 ug/g的限量。 图6甲磺酸伊马替尼供供品中2-甲基-5-硝基苯胺分析图谱 结论 采用 LC-MS/MS 法测定药物中的遗传毒性杂质具有选择性好，灵敏度高的优点，目前正越来越多的应用于新药研发中遗传毒性杂质的检测。本文使用岛津LCMS-8060 三重四极杆液相色谱质谱联用系统建立了甲磺酸伊马替尼中潜在遗传毒性杂质2-甲基-5-硝基苯胺的测定方法。2-甲基-5-硝基苯胺在5~60 ng/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法简单、快速、且灵敏度和准确度高，可为相关药品的检测工作提供快速准确的支持，进一步为药品安全提供技术保障。 Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 建立了岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪LCMS-8060测定甲磺酸伊马替尼中潜在芳香胺类遗传毒性杂质2-甲基-5-硝基苯胺含量的方法。2-甲基-5-硝基苯胺在5~60 ng/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r值在0.999以上，且精密度实验结果良好，低中高浓度加标回收率在94.1%~95.7%。此方法灵敏度高，检测时间短，结果准确，可供甲磺酸伊马替尼质量控制参考。