thermoscientific热线8008105118电话 400 6505118Www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2018 Thermo Fisher Scientific Inc.保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产,除非另有指明。 IC与Q Exactive高分辨质谱仪联用实现未标记IgG N-糖链的鉴定 陈兵,韩春霞赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词: Q Exactive; 离子色谱;未标记;N-糖链 前言 糖基化对蛋白药物的疗效,稳定性,免疫原性具有重要的影响。以单克隆抗体为例,常见的N-糖型主要为GOF、G1F、G2F、G1F-GlcNAc、GOF-GlcNAc等;如果出现OligoMan、Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型,则会影响免疫原性或半衰期,需要避免;另外,可以通过细胞工程及分子生物学技术,提高A-Fuc, GlcNAc bisecting, G2F, Hyper Sialyation(NANA)的含量,以增强ADCC, CDC, Anti-inflammatory等效能。寡糖为非模板型合成,并呈树状结构,其结构极其复杂,仅由6种单糖组成的寡糖链,其理论结构就可达到1012种,因此要求用于寡糖的分析设备具有强悍的分析性能。 糖链常用的分析方法有:液相色谱法、毛细管电泳法和高效阴离子交换色谱法。其中,液相色谱法为当前最常用的分析方法,主要采用HILIC色谱柱和赛默飞独有的GlycanPac AXH-1色谱柱进行分离,90%以上的糖链分析都使用此方法。高效阴离子交换色谱法一般与脉冲安培检测器联用(HPAE-PAD)对寡糖进行检测。 图1.单克隆抗体N-糖链(a)LC-MS/MS完整分析流程, (b)IC-MS分斤流程 LC-MS联用分析N-糖链(由天冬酰胺连接寡糖)结构的流程包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤(图1a)。寡糖链释放需根据不同的糖基化类型选择不同的方法,N-糖链主要使用PNGase F酶切。衍生化标记可以增强寡糖的质谱响应,其中,还原末端标记2-AB等苯胺或杂环化合物还可以使寡糖链通过荧光检测,全甲基化标记增强寡糖链的疏水性,实现反相分离检测。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱具有高灵敏度的优势,用于糖链分析能取得满意的结果。 然而LCMS的方法要求将糖链衍生化后再进行分析,样品前处理耗时长,操作复杂。而HPAE-PAD可以直接分析未衍生化的糖链,避免样品在标记过程中唾液酸的降解,减少了前处理的步骤和样品前处理的时间。图1b为ICMS联用分析N-糖链的工作流程, lgG寡糖链释放后直接用Dionex CarboPac PA200色谱柱分离,再用安培检测器和Q Exactive质谱分析。 本实验建立了基于IC-Q Exactive的未标记IgG N-糖链分析流程(图1b),为未标记N-糖链提供快速、简便的分析方法。 图2.Thermo Scientific Dionex ICS-5000+离子色谱与QExactive质谱仪联用实物图 2.1仪器和试剂 质谱仪器: Q Exactive (赛默飞世尔科技,美国); 色谱仪器:U3000液相色谱系统(赛默飞世尔科技,美国); 色谱柱: Dionex CarboPac PA200 (3x250) PN 062896 试剂:二次去离子水,氢氧化钠(分析纯),乙酸钠(分析纯)。 2.2仪器方法 离子色谱分析条件:具体见表1; 质谱分析条件:具体见表2; 检测器温度 洗脱梯度 Time (min) A (%) B (%) C (%) Slope -5 100 0 0 5 10 100 0 0 5 25 98 2 0 5 55 84 16 0 5 80 60 40 0 5 80.1 0 100 0 5 85 0 100 0 5 85.1 0 0 100 5 90 0 0 100 5 表2.质谱分析条件 扫描模式 负离子 喷雾电压 3.3kV 毛细管加热温度 320℃ S-lens 50% 鞘气流速 40 (arb) 辅助气流速 10( (arb) 质量扫描范围 m/z 400-2200 分辨率 140.000 @m/z 200 3.结果与讨论 本实验使用Dionex CarboPac PA200色谱柱,按表1的洗脱梯度对未标记的IgG N-糖链进行分离,用Q Exactive高分辨质谱进行检测,质谱参数详见表2。离子色谱用的淋洗液为50mM氢氧化钠和250mM醋酸钠,在阴离子交换色谱柱上通过梯度洗脱将糖链分离。由于淋洗液中含有高浓农非挥发性的盐,在淋洗液进质谱前必须用抑制器将Na+离子置换成H+离子从而达到在线脱盐的目的。本次实验在安培检测器上鉴定到17种N糖型,在质谱上鉴定到27种N糖型(见图3)。质谱结果中各糖型实测质量与理论质量相比,质量偏差都在3ppm以内。图4为G0F、G1F、G2F、G1F-GIcNAc和G0F-GlcNAc糖型的提取离子色谱图,质谱对未标记的N-糖型检测也能达到非常强的响应强度。 图3.ED安培检测器和MS检测N-糖型结果 图4.部分糖型的提取离子色谱图 4.结论 本实验采用IC-Q Exactive高分辨质谱仪对未标记IgG N-糖链进行测定,建立了IC-Q EExactive分析N-糖链的色谱和质谱方法,为糖蛋白N-糖链的研发和生产检测提供快速、简便的分析平台。实验结果表明IC-Q Exactive在糖型分析中有多多优势:无标记过程,减少唾液酸降解,糖型检出覆盖率高,适用于复杂唾液酸修饰糖型,极大的完善和推动了糖蛋白类药物N-糖链的质控分析。 糖基化对蛋白药物的疗效,稳定性,免 疫 原 性 具 有 重 要 的 影 响 。 以 单 克隆 抗 体 为 例 , 常 见 的 N - 糖 型 主 要 为G0F、G1F、G2F、G1F-GlcNAc、G0F-GlcNAc等;如果出现OligoMan、Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型,则会影响免疫原性或半衰期,需要避免;另外,可以通过细胞工程及分子生物学技术,提高A-Fuc,GlcNAc bisecting,G2F,Hyper Sialyation(NANA)的含量,以增强ADCC,CDC,Anti-inflammatory等效能。寡糖为非模板型合成,并呈树状结构,其结构极其复杂,仅由6种单糖组成的寡糖链,其理论结构就可达到1012种,因此要求用于寡糖的分析设备具有强悍的分析性能。本实验采用IC-Q Exactive高分辨质谱仪对未标记IgG N-糖链进行测定,建立了IC-Q Exactive分析N-糖链的色谱和质谱方法,为糖蛋白N-糖链的研发和生产检测提供快速、简便的分析平台。实验结果表明IC-Q Exactive在糖型分析中有诸多优势:无标记过程,减少唾液酸降解,糖型检出覆盖率高,适用于复杂唾液酸修饰糖型,极大的完善和推动了糖蛋白类药物N-糖链的质控分析。