头孢克肟中杂质分析检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific DGLC在线除盐与Q Exactive MS高分辨质谱联用系统在头孢克肟杂质分析中的应用 刘国强，吴珊湖，徐牛生三!赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 摘要 本文利用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪，结合DGLC双三元液相在线除盐系统，对头孢克肟胶囊中4个氧化降解杂质进行定性分析。通过Obitrap获得的高质量精度的一级和二级质谱信息，结合头孢克肟的碎片裂解规律，推断出了未知杂质的结构。本文所述的工作流程无需改变现有的一维分析方法就可轻松使用LC-MS联用技术对药物杂质进行更深入的研究。 1.引言 在液相色谱方法的开发中，常会用到一些添加剂(如磷酸盐缓冲溶液或离子对试剂)以改善色谱保留行为及峰形，但是这些添加剂经常无法兼容质谱检测。而对于药物杂质分析来说，经常需要对某些新产生的杂质进行质谱鉴定，同时又不希望改变方法选择性以便通过保留时间对未知物进行定性。但是如果将原有方法中不能兼容质谱条件的添加剂改变的话，很可能造成选择性变化，从而无法定位欲分析的未知化合物的出峰位置。 头孢克肟( Cefixime) 为口服用的第三代头孢菌素类抗生素，适用于治疗敏感菌所致的呼吸、泌尿和胆道等部位的感染。在2015版《药典》二部中，有关物质分析使用了四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节pH=7)的离子对试剂。在不改变原流动相条件的情况下，本实验采用DGLC的流动相在线除盐技术，结合Q Exactive MS高分辨质谱对头孢克肟胶囊中4个目标杂质(氧化降解杂质)进行在线除盐及定性分析。利用MS获得的二级质谱信息，结合头孢克肟的碎片裂解规律，推断出了未知杂质的结构。 2.实验部分 2.1色谱条件 仪器： Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 DGLC双三元液相色谱仪 一维色谱柱： Inertsil ODS-3(3um， 4.6×150 mm) ( 二维色谱柱： Ther m o ScientificTM Hy p ersil G OLDTM aQ (1 . 9 um， 100x2.1mm) ) 一维流动相：乙腈：四丁基氢氧化铵溶液(10%四丁基氢氧化铵溶液25ml， 加水至1000ml，用1.5 M H3PO4调节pH 至6.5)=240：760 二维流动相：A水(含0.1%甲酸)，B为乙腈紫外检测波长：254nm 柱温：40℃ ( 进样量：5pL ) 仪器： Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱 HESI离子源参数： Spray Voltage +3.5KV/-2.8KV，正负离子模式； Sheath Gas Pressure： 40arb； Aux Gas Pressure： 10arb； Ca-pillary Temp： 300℃； Heater Temp： 400℃。 质谱扫描参数：全扫描范围150-1500 m/z，分辨率 70，000FWHM：二级：数据依赖自动触发；母离子隔离窗口1.5 amu；分辨率17，500 FWHM。 2.3样品制备 称取头孢克肟胶囊内容物约120mg(约相当于头孢克肟100mg)置100ml量瓶中，加入5ml稀释剂使分散，再加入1ml3% H2O2，室温放置30 min， 加稀释剂约至量瓶体积的70%，超声30 min， 期间不时振摇，使头孢克肟溶解，放冷至室温，用稀释剂定容至刻度，高速离心取上清直接进样分析。 3.实验结果与讨论 3.1DGLC在线除盐系统 赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱(DGLC)可实现在线去除流动相中的非挥发性缓冲盐，无需改变现有的分析方法就可轻松使用LC-MS联用技术对药物杂质进行更深入的研究。此系统在一个模块下实现独特的双泵设计，每个泵可作为一个单独的体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，可同时单独控制三种不同的流动相，在Chromeleon变色龙软件的支持下，结合独特的阀切换技术，通过灵活的流路连接设计，可以将流动相中的非挥发性缓冲盐在线去除(如图1所示)。结合Q ExactiveMS高分辨质谱，可应对非挥发性缓冲盐体系杂质分析的挑战。 图1.双三元液相色谱(DGLC)在线除盐示意图 3.2有关杂质的DGLC在线除盐分析 通过双三元液相色谱(DGLC)分析，第二维使用甲酸水及乙腈的质谱可兼容的挥发性流动相体系。通过在线除盐之后，第二维上均可检测到相关杂质信号，其在第二维的保留时间分别为17.51，18.46，86.10，108.53 min， 如图2所示。 图2.目标杂质及API在第二维上的提取离子流图 3.3API(头孢克肟)的质谱分析 Q Exactive进样一针可同时获得正负离子两个模式的质谱图，可以在更短的时间内和更少量的样品条件下获得化合物的结构m/z 454.04852， [M-H]- m/z 452.03442， 由Xcalibur软件拟合可得其分子式为C16H15O7N5S2，质量偏差均在1ppm左右(如图3所示)。 图3.正负离子模式下API(头孢克肟)的一级质谱图 正离子模式下的二级质谱图，可见[M+H]+通过RDA所得的特征性碎片离子m/z 285.02866，此外还可见特征性碎片离子m/z210.02031，152.0631，和126.01214，碎片离子的结构如图4中所示。 图4.正离子模式下API(头孢克肟)的二级质谱图 3.4目标杂质的定性分析 正离子模式下一级质谱测得四个目标杂质的精确质量数分别为[M+H]+m/z 470.04349， 470.04309，488.05433，和472.05913， 由Xcalibur软件拟合可得其分子式分别为C16H15O8N5S2，C16H15O8N5S2，C16H17O9N5S2，和C16H17O8N5S2(如图5所示)。 正离子模式下二级质谱测得四个目标杂质[M+H]+的主要特征性碎片离子m/z 168.01112和m/z 126.01214，结合MassFrontier结构解析软件及头孢克肟中报道的已知杂质，推测杂质1为Cefi-xime Sulfoxide， 杂质2为Cefixime Impurity D Sulfoxide，杂质3为Cefixime impurity A Sulfoxide，杂质4为Cefixime impurity A 或其同分异构体(如图6所示)。 图6.正离子模式下4个目标杂质的二级质谱图 4.总结 Q Exactive质谱仪将高性能四及杆与高分辨静电场轨道阱 Orbi-trap 检测技术相结合，能够在保持高质量精度和灵敏度的前提下进行快速的正负切换，获得最全面的未知成分信息。一针进样，即同时获得正、负离子模式下的一级和二级质谱图。 本次实验，在未改变含非挥发性离子对试剂流动相体系的条件下，使用DG-LC MS方法对头孢克肟胶囊氧化破坏供试品溶液中4个目标杂质进行了定性分析，由一级质谱分析可知，杂质1-4的分子式分别为C16H15O8N5S2，C16H15O8N5S2，C16H1709N5S2，C16H17O8N5S2，其中杂质1和2互为异构体。通过二级碎片分析，推测此4个杂质分别为CefiximeSulfoxide， Cefixime Impurity D Sulfoxide， Cefixime impurity ASulfoxide， 和Cefixime impurity A 或其同分异构体。 thermoscientific SCIENTIFIC 热线话 ww.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎ Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 本文利用Thermo Scientific™ Q Exactive™ 四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪，结合DGLC双三元液相在线除盐系统，对头孢克肟胶囊中4个氧化降解杂质进行定性分析。通过Obitrap获得的高质量精度的一级和二级质谱信息，结合头孢克肟的碎片裂解规律，推断出了未知杂质的结构。本文所述的工作流程无需改变现有的一维分析方法就可轻松使用LC-MS联用技术对药物杂质进行更深入的研究。Q Exactive质谱仪将高性能四极杆与高分辨静电场轨道阱 Orbi-trap 检测技术相结合，能够在保持高质量精度和灵敏度的前提下进行快速的正负切换，获得最全面的未知成分信息。一针进样，即同时获得正、负离子模式下的一级和二级质谱图。本次实验，在未改变含非挥发性离子对试剂流动相体系的条件下，使用DG-LC MS方法对头孢克肟胶囊氧化破坏供试品溶液中4个目标杂质进行了定性分析，由一级质谱分析可知，杂质1-4的分子式分别为C16H15O8N5S2,C16H15O8N5S2, C16H17O9N5S2,C16H17O8N5S2,其中杂质1和2互为异构体。通过二级碎片分析，推测此4个杂质分别为Cefixime Sulfoxide，Cefixime Impurity D Sulfoxide，Cefixime impurity A Sulfoxide，和Cefixime impurity A 或其同分异构体。