医用胶塞中可提取物定性分析检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific thermoscientific电话400 6505118www.thermofisher.com 医用胶塞中可提取物Q Exactive高分辨质谱定性分析 刘国强，徐牛生赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： Q Exactive、包材相容性、可提取物(Extractable)、Compound Discoverer 本文利用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 高分辨液质联用技术，结合Compound Discoverer软件及相关E &L 数据库，对医用胶塞中可提取物进行了鉴定。通过在线和离线二级数据库进行未知成分的快速检索鉴定，对于没有二级质谱库的Extracta-ble成分，使用创新的mzLogic算法，对候选结构进行筛选和排序，进一步获得可能的结构。最终从样品中鉴定出52个可能性的Extractable成分。本文所述的工作流程有利于为诸如制药和食品工业等需要进行可提取研究的领域提供未知化合物鉴定的解决方案。 1.引言 药包材的选择对于确保药品质量有着举足轻重的作用。不恰当的包装材料会引发药物活性成分的迁移、吸附甚至使其发生化学反应，导致药物失效，有的还会导致药物对人体产生严重的不良反应。从近期陆续出台的相容性指导原则及注射剂一致性评价征求意见，均可看出包材相容性在药品安全性研究中占据着日益重要的作用。 可提取和浸出物(Extractable & Leachable) 是相容性实验的主要研究对象。可提取物是指在可控的提取条件下从包装材料或设备组分中提取出的化合物，浸出物则是在正常保质期内从包装材料迁移至产品中的化合物。在理想情况下，浸出物也可视作一种可提取物。分析方法根据目的不同又可分为靶标分析和非靶标分析。质谱技术，特别是高分辨质谱技术，因其对未知物高灵敏度的定性能力，被越来越多的应用于E&L的非靶标分析。在可提取物分析中面临的最大挑战就是对未知物的准确快速鉴定，因为很少有树脂生产商能够提供包装材料聚合物中所 使用的全部添加剂的完整清单，并且原材料在生产过程中可能会降解或发生化学变化。本文采用Q Exactive高分辨液质联用技术，结合Compound Discoverer 定性软件及相关E&L数据库，以胶塞为例，对其可提取物成分进行了系统分析。此分析方法可为包材相容性研究中的E&L分析提供一定的借鉴意义。 2.实验部分 2.1色谱条件 仪器： Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 RS超快速液相色谱仪 色谱柱： Thermo ScientificTM Hypersil GOLDTM aQ (1.9 um， 100x2.1mm)； 柱温：45℃； 进样量：5pL； 流动相：A为水(含0.1%甲酸)，B为乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱程序如表1。 表1.液相色谱梯度洗脱程序 时间 A% B% 流速mL/min 0 90 10 0.35 1 90 10 0.35 15 5 95 0.35 30 5 95 0.35 30.1 90 10 0.35 33 90 10 0.35 仪器： Thermo ScientificTM Q ExactiveTM四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱 HESI离子源参数：Spray Voltage +3.5KV， 正离子模式； SheathGas Pressure： 40arb； Aux Gas Pressure： 10arb； Capillary Temp：300℃； Heater Temp： 400℃。 质谱扫描参数：全扫描范围120-1200 m/z， 分辨率70，000FWHM：二级：数据依赖自动触发；母离子隔离窗口1.5 amu；分辨率17，500 FWHM。 2.3样品制备 胶塞剪碎后分别用一定体积的去离子水，0.1M磷酸，50 mM醋酸铵(pH10)，和异丙醇(IPA)超声提取60 min，离心取上清后直接进样分析。 3.实验结果与讨论 3.1提取溶剂的选择 此实验采用四种不同的提取溶剂，分别为去离子水，0.1M磷酸，50mM 醋酸铵(pH 10)，和IPA，涵盖较大的极性范围，以确保非极性和极性分析物均能被提取。从TIC， PCA， 和箱体图上可知，IPA提取出的成分与另外3组提取液具有较明显的差异。 图1.四种不同提取溶剂的总离子流图 图2.胶塞提取物的PCA分析(2A)及磷酸三乙酯的箱体图(2B) 数据处理采用Compound Discoverer (简称CD)的 E and L w Sta-tistics Unknown ID w Online and Local Database Searches工作流程进行成分鉴定。实现自动峰提取、空白扣除、分子式生成等步骤，通过在线和离线多种质谱数据库检索对E&L成分进行检索鉴定(如图3)。采用全新的mzLogic算法对完全未知物进行结构推断。在对数据完成峰提取后，CD将化合物所归属的一级和二级质谱数据与mzCloud或mzVault数据库进行匹配。匹配参数：离子活化能偏差<20，质量偏差<5 ppm， 鉴定算法：Cosine，匹配阈值：50%。满足以上匹配条件的结果将返回到CD软件中。由软件界面(图4)可以直观的看见鉴定化合物列表，选定的化合物提取离子流图，化合物结构及匹配分值，二级质谱镜像图等信息。对谱库中已收录的E&L化合物进行高效准确的鉴定。 图3. Compound DiscovererE&L分析工作流程 图4. Compound Discoverer鉴定结果界面 3.3 mzLogic应用于未知E&L分析 对于V库中具有二级质谱图E&L成分，可以通过CD直接进行谱库比对快速进行鉴定。然而由于E&L成分的高度复杂性，很大一部分的成分并没法获得标准品进行谱库的构建。对于没有二级质谱图比对的这些成分，则可以首先通过CD计算出该未知物分子式，然后通过分子式和精确质量数检索可能的结构。但因为同分异构体众多，往往对结构推断形成挑战。以m/z 183.07793的峰为例， CD结合精确质量数，同位素丰度比，氮率，C/H比等多个维度，计算该分子式为CHPO。使用Chemspider search node， 检索获得超过20个同分异体结果，通过传统方法，需要花费大量精力用于筛选和排除。 mzLogic使用创新的算法，将mzCloud与Chemspider有机结合，通过利用mzCloud超过2，800，000张多级谱图中的海量碎片结构信息，对所有的候选结构进行快速解析、匹配和排序。通过排序，得出>90分的Top1结构为磷酸三乙酯，又称阻燃剂TEP， 为高沸点溶剂，常作为橡胶和塑料的增塑剂。同时，利用碎片检索结果，对二级谱图进行了解析和标注(图5)。mzLo-gic为完全未知E&L结构分析提供了一种高效、批量的智能筛选方案。 图5.mzLogic算法对候选结构进行筛选排序 4.总结 本实验采用Q Exactive高分辨液质联用技术，结合CompoundDiscoverer软件中E and L w Statistics Unknown ID w Online andLocal Database Searches工作流程，对医用胶塞中可提取物进行了鉴定。通过在线和离线数据库对已收载的成分进行检索，对于没有二级质谱库的Extractable成分，使用创新的mzLogic算法，利用mzCloud已收载的数百万个碎片结构，对候选结构进行筛选和排序，进一步获得可能的结构，最终从样品中鉴定出52个可能性的Extractable成分(鉴定的主要结果请见表2)。本文所述的工作流程有利于为诸如制药和食品工业等需要进行可提取研究的领域提供未知化合物鉴定的解决方案。 表2.胶塞样品中主要可提取物(Extractable)鉴定结果 热线800 8105118 SCIENTIFIC 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎ Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 本文利用Thermo Scientific™ Q Exactive™ 高分辨液质联用技术，结合Compound Discoverer软件及相关E & L 数据库，对医用胶塞中可提取物进行了鉴定。通过在线和离线二级数据库进行未知成分的快速检索鉴定，对于没有二级质谱库的Extracta-ble成分，使用创新的mzLogic算法，对候选结构进行筛选和排序，进一步获得可能的结构。最终从样品中鉴定出52个可能性的Extractable成分。本文所述的工作流程有利于为诸如制药和食品工业等需要进行可提取研究的领域提供未知化合物鉴定的解决方案。本实验采用Q Exactive高分辨液质联用技术，结合Compound Discoverer软件中E and L w Statistics Unknown ID w Online and Local Database Searches工作流程，对医用胶塞中可提取物进行了鉴定。通过在线和离线数据库对已收载的成分进行检索，对于没有二级质谱库的Extractable成分，使用创新的mzLogic算法，利用mzCloud已收载的数百万个碎片结构，对候选结构进行筛选和排序，进一步获得可能的结构，最终从样品中鉴定出52个可能性的Extractable成分（鉴定的主要结果请见表2）。本文所述的工作流程有利于为诸如制药和食品工业等需要进行可提取研究的领域提供未知化合物鉴定的解决方案。