西替利嗪原研药与仿制药中杂质谱检测方案(液相色谱仪)

非目标杂质谱； Compound Discoverer 2.0； QExactive Focus；静电场轨道阱高分辨质谱；仿制药 1.引言 仿制药是指与原研药在剂量、安全性、效力、质量、作用以及适应症上相同的一种仿制品。2016年3月6日，国务院办公厅日前印发《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》，要求化学药品新注册分类实施前批准上市的仿制药，凡未按照与原研药品质量和疗效一致原则审批的，均须开展一致性评价。自首家品种通过一致性评价后，其他药品生产企业的相同品种原则上应在3年内完成一致性评价；逾期未完成的，不予再注册。 高质量的仿制药应做到“生物等同，临床等同，安全等同”。若能控制原料药或制剂中的杂质含量，做到仿制药中各组分与原研药相同，便能一定程度上保障仿制药与原研药在安全性上一致，也为生物等同，临床等同提供基础。目前对于仿制药质量一致性评价多从释放度及临床疗效上加以评价，未有从杂质谱角度予以关注。 本文采用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱QExactiveTM Focus高分辨质谱联用技术，结合 Thermo 新一代的智能小分子化合物分析软件 Compound Discoverer 2.0， 对西替利嗪杂质谱进行了轮廓比对分析，为仿制药质量一致性评价提供一种新的研究思路。 图1.基于QExactive Focus 和 Compound Discoverer的杂质谱分析流程 2.实验条件 2.1液相色谱条件 仪器： Thermo Fisher UltiMate 3000 超高效液相色谱仪 色谱柱： Hypersil Gold C18 (100×2.1 mm， 1.9 um)流动相：A为水相：0.1%甲酸水，B为有机相：0.1%乙腈 梯度条件： 时间(min) A% B% 0 5 2 5 仪器： Thermo Q Exactive Focus 四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱。 HESI 离子源参数： SprayVoltage+3.5KV， 正离子模式； SheathGas Pressure： 40 arb； Aux Gas Pressure： 10 arb； CapillaryTemp： 300℃； Heater Temp：350℃。 质谱扫描参数：全扫描范围150-800 m/z， 分辨率70，000FWHM；二级： Discovery 数据依赖自动触发；母离子隔离窗口1.5amu；分辨率17，500 FWHM。 2.3样品制备 取仙特明、西可韦、希瓦丁西替利嗪片(10mg规格)各三个批次样品适量，加乙乙：水(50：50)溶解，离心后取上清液适量用乙腈：水(20：80)稀释至0.2 mg/mL 后进样分析。 3.结果和讨论 3.1原始数据比对 Q Exactive Focus 采用 Fullscan-ddms2 的方式，一次进样即可获得一级和二级的丰富数据(图2)。但是传统的方法需要手工逐个从总离子流中挑选具有价值的质谱信号加以鉴定分析，无法有效的对不同品牌，不同批次的药物进行批量统计分析，更难以快速准确地筛选出对其中的差异组分。需要一种有效的数据处理方法对原研药与仿制药进行比对，找出其中的质量差异。 图2.西替利嗪总离子流图(自上而下分别为希瓦丁、仙特明、西可韦) 3.2 Compound Discoverer 2.0 软件实现非目标杂质谱比对 3.2.1非目标杂质谱分析工作模板 在 Compound Discoverer 中已建有环境研究、食品安全、司法毒物、药物杂质、代谢物、代谢组学等多个通用性模板，可以根据研究项目进行选择。也可以在此基础上进行灵活的编辑 数据处理流程，满足更深层次的研究需要。在本例中，选择已建好的 Unknown Impurity 模板，对西替利嗪杂质数据进行分析处理(图3)。 图 3. Unknown Impurity分析模板 3.2.2峰对齐和峰提取 Compound Discoverer 首先进行有效信号的筛选，将响应低于100，000， S/N小于5的信号滤除，再进一步对不同批次的数据根据液质信号特征进行有效对齐，进而根据质谱信号和色谱保留进行峰提取，将不同加合态、不同带电数及同位素特征进行合并处理，获得最终的有效峰信息。 C) Show Related Tables 图4.数据对齐和峰提取处理 3.2.3主成分分析 PCA 采用主成分分析PCA对原研药仙特明(XTM)，仿制药西可韦(XKW)和希瓦丁(XWD)进行降维分析，从图5可以看出，第一维PC1可以对 43.1%的变量进行解释，PC2可对25.8%的变量进行解释，前三维的变量可解释85.7%的变量。从主成分分析结果可知，原研药和仿制药存在较显著的差异，而导致差异的组分很可能为关注的差异杂质。 XKW XTM XWD 图 5.PCA主成分分析 3.2.4差异组分的分析 为进一步分析差异组分，Compound Discoverer 计算提取峰的峰面积，将提取峰散落在以 log， Fold change 为X轴，-log. P-Value 为由 轴的 volcano plot 图中(图6)。进一步调整 log， Fold change 和 -log， P-Value阈值，选取差异组分，图中浅蓝色和浅红色框中的部分即为存在有较大差异的杂质组 分。 图6. Volcano Plot (XKW vs XTM) 3.2.5 未知差异杂质碎片分析和鉴定 软件将调用碎裂数据库(FragmentationLibrary)快速的对西替利嗪的碎片结构进行归属，该数据库几乎涵盖了所有已发表 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 的文献，保证了碎片解析的准确性。在获得差异杂质后，软件可对不同组分之间的二级质谱进行比对，进一步对杂质变化位点进行推测(图7)。 图7.二级质谱碎片归属比对结果 4.小结： 结合高性能的 QExactiv Focus 高分辨质谱仪和新一代小分子化合物分析软件 Compound Discoverer，开发了非目标杂质谱比对工作流程(图8)。通过该方法可以有效的评估仿制药与原研药杂质系统概况，对其中存在差异的杂质进行快速筛选鉴定。进而通过杂质成因分析和含量监控，，可以有效的保障仿制药用药安全，为仿制药质量一致性评价提供一种新的研究思路和方法。 图8.基于 Compound Discoverer 的非目标杂质谱比对工作流程 SCIENTIFIC 支持手机用户)A Thermo Fisher Scientific Brand