采用LabSolutions™ MD软件进行基于分析质量源于设计的高效方法开发

本文介绍了使用LabSolutions MD对小分子药物进行基于分析质量源于设计（AQbD）的高效稳健分析方法开发。基于AQbD的方法开发由3个阶段组成，包括筛选、优化和验证。LabSolutions MD的专用功能为每个阶段提供支持，例如实验设计、通过自动峰跟踪功能构建设计空间以及耐用性评估，从而实现高效的方法开发。C190-E296 Application 采用 LabSolutionsTM MD 软件进行基于分析 质量源于设计的高效方法开发 Shinichi Fujisaki ， Satoru Watanabe， Tomohiro Kawase ， Yuichiro Fujita ， Keiko Matsumoto' 本文介绍了使用 LabSolutions MD 对小分子药物进行基于分析质量源于设计 (AQbD) 的高效稳健分析方法开发。基于 AQbD 的方法开发由 3个阶段组成，包括筛选、优化和验证。LabSolutions MD 的专用功能为每个阶段提供支持，例如实验设计、通过自动峰跟踪功能构建设计 空间以及耐用性评估，从而实现高效的方法开发。 关键词： LabSolutions MD， AQbD，方法开发，方法筛选，实验设计 1.背景 人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH) 建议采用AQbD 方法进行方法开发。建议通过高效实验获取数据，例如，进行实 验设计并验证对分析结果有较大影响的参数，然后构建设计空间，以了解参数相对于分析结果的有效范围。基于风险评估的方法可 确保开发出耐用性好、风险性低的分析方法，而不是依赖于用户 的经验。 2. LabSolutions MD 概述 LabSolutions MD 支持基于 AQbD 各阶段的高效方法开发(图 1)。该软件包括几个功能，用于根据实验设计创建批处理分析(图2)和数据分析，如构建设计空间和模拟色谱图(图3)。可以生成自 动切换流动相和色谱柱进行筛选的批处理分析。此外，采用实验 设计，可以用更少的分析次数找到最佳条件。在图2中，步骤(1)至(6)展示了如何简单快速地创建批处理分析。 图1 使用 LabSolutions MD 的高效方法开发 点击软件中的图标可以直接选择流动相和色谱柱，自动生成 包括色谱柱平衡的批处理表， LabSolutions MD 软件还支持不同 的实验设计模型，这不仅提高了实验效率，还减少了人为错误。数据分析功能支持峰跟踪自动鉴别目标化合物，可视化设计空间 以确定最佳条件，并且可预测不同的分析条件下模拟色谱图。此 外，通过方差分析，可以确定对分离有较大影响的参数。本文以 小分子药物为例描述了方法开发的工作流程，包括筛选、优化和 验证。 图2 创建批处理分析功能 图3 数据分析功能 3. 分析 3-1. 样品信息 表1为用于方法开发的小分子药物及其物理性质。作为典型案 例，选择具有不同 log P 和 pKa 的小分子药物。 表1：样品信息 序号 化合物 log P pKa 1 丙磺舒 3.21 3.4 2 (S)-(+)-萘普生 3.18 4.15 3 乙酰水杨酸 1.19 3.49 4 双氯芬酸钠 4.51 4.15 5 盐酸罂粟碱 3 6.4 6 盐酸地布卡因 4.4 8.85 7 盐酸阿米替林 4.92 9.4 8 吲哚美辛 4.27 4.5 9 安替比林 0.38 1.4 10 利多卡因 2.44 8.01 11 奎尼丁 3.44 8.56 12 甲氧氯普胺 2.62 9.27 3-2.筛选阶段 对于筛选阶段，由于流动相和色谱柱通常对分离有很大影响，所以在方法开发的初始阶段对这些因子进行筛选。本实验采用全 因子实验设计，考察了流动相水相(缓冲液)2种、有机相3种 和色谱柱6种，共获得36(2×3×6)个数据(表2)。每种缓 冲液(泵A) 的pH值以及有机溶剂的比例(泵B)由溶剂混合 功能自动调节。流动相选择和色谱柱切换在分析过程中自动进行，大大提高了方法开发阶段的整体效率。 表2筛选阶段的流动相和色谱柱 流动相： 泵A 缓冲液1 A1 20mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液 (pH2.7) A2 20mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液 (pH 6.8)泵B 有机溶剂2B1 乙腈B2 乙腈/甲醇=50：50B3 甲醇色谱柱：1 Shim-pack Scepter C18-120(100mmx3.0mml.D.，1.9pm)2 Shim-pack Scepter C8-120 (100mmx3.0mml.D.，1.9pm)43 Shim-pack Scepter C4-300 (100mmx3.0mml.D.，1.9pm)’4 Shim-pack Scepter Phenyl-120 (100mmx3.0mml.D.，1.9pm)5 Shim-pack Scepter PFPP-120 (100mmx3.0mml.D.，1.9pm)"6 Shim-pack GIST C18AQHQ(100mmx3.0mml.D.，2.0pm)分析条件：时间程序：B浓度 5%(0min)→80%(8.01-11 min)→5%(11.01-15 min)流速 ： 0.7mL/min进样量 ：1.0uL柱温 ：40°C检测 ： Max plot 220-400 nm (SPD-M40) *1下面的流动相水相通过溶剂混合功能自动制备。 溶剂 A1比例 A2 比例 A 50 mmol/L 磷酸水溶液 16% 0% B 50 mmol/L 磷酸二氢钠水溶液 24% 24% C 50 mmol/L 磷酸氢二钠水溶液 0% 16% D 水 60% 60% *2下面的流动相有机相是通过溶剂混合功能自动制备。 溶剂 B1比例 B2 比例 B3 比例 A 乙腈 100% 50% 0% B 甲醇 0% 50% 100% *3 P/N 227-31013-03*6 P/N 227-31064-03 *4 P/N 227-31034-03 *7 P/N 227-31054-03 *5 P/N 227-31176-03 *8 P/N 227-30808-02 3-3. 筛选阶段的色谱图 图4显示了 Shim-pack Scepter Phenyl-120 获得的色谱图。洗脱出 14个峰，包括奎尼丁和乙酰水杨酸的杂质。经证实，每 种化合物的保留时间和分离度会因水相的pH值、有机相种类和 色谱柱的类型而发生显著变化。 mAU(x1，000) 图4Shim-pack Scepter Phenyl-120 的色谱图 3-4.快速找到最佳条件 因为筛选阶段生成的色谱图与分析条件数量一样多，所以必须 对它们进行评估，以确定哪一个分析方法是最佳的。如果必须逐 一检查所有色谱图，将会花费大量时间和成本。LabSolutions MD 可以使用下面的公式(1)快速轻松地找到最佳条件，以定量评 估色谱分离。 评估值(E)的计算方式为检出峰数(P)乘以所有峰的分离度 (Rs)之和。图5以从最高到最低的顺序显示了筛选阶段各分析 条件获得的评估值。结果表明，当水相为20mmol/L(钠)磷酸 盐缓冲液(pH 6.8)、有机相为乙腈/甲醇=50：50以及色谱柱 为 Shim-pack Scepter Phenyl-120 时，获得了最高的评估值(图4：绿色色谱图)。 响应值 色谱柱名称 MPA pH MPBA (%) 评估值 最低分离度 Scepter-Phenyl-120 6.8 50 546.000 3.224 Scepter-CS-120 6.8 0 469.894 0.093 GIST-C18-AQ 2.7 0 465.124 1.075 GIST-C18-AQ 6.8 50 443.580 1.826 Scepter-C8-120 6.8 50 436.241 0.026 Scepter-Phenyl-120 2.7 50 419.659 1.743 Scepter-C18 2.7 0 419.338 1.518 Scepter-C18 6.8 50 396.000 4.326 Scepter-C4-300 2.7 0 394.239 0.402 Scepter-C18 6.8 100 384.553 2.046 图5按评估值对分析条件(流动相和色谱柱)的排序 (从最高到最低显示) 3-5. 使用方差分析确定对分离有重大 影响的参数 使用方差分析，可以量化每个参数(如流动相、色谱柱等)对 分离的影响程度。确定对分离有重大影响的参数有助于决定在优 化阶段应进一步考虑哪些参数，从而提高方法开发的效率。 图6显示了每个参数的方差分析结果。“流动相A×流动相B"和“色谱柱”((红色)的p值均小于0.05。认为p值为0.05或 更小的参数可以在每个水平上是不同的(例如分离度)，表明它 们对分离有很大的影响。 ANOVA 表格 显示绘图 影响 MPApHxMPBB (%) SSR df MS F值 6.72 p值 0.0141 44817.9 2 22408.9 区 色谱柱名称 色谱柱名称xMPA pH 66312.0 35853.2 5113262.4 3.98 2.15 一0.0302 5 7170.6 0.142 色谱柱名称xMPS B(%) 50149.0 10 5014.9 1.50 0.265 区 MPBB (K) 9123.7 2 4561.9 1.37 0.298 区 MPA pH 3243.6 1 3243.6 0.973 0347 错误 33336.5 10 3333.7 总计 242835.8 351 图6 方差分析结果 3-6. 筛选结果 表3显示了在筛选阶段获得的具有最高评估值的最佳条件。使 用水相为20 mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液 (pH6.8)、有机相为 乙腈/甲醇=50：50以及色谱柱为 Shim-pack Scepter Phenyl-120获得了最佳条件。在优化阶段(3.7)，对方法进行进一步优化，包括泵的梯度程序和柱温箱温度。 表3 评估值最高的条件 流动相：泵A 缓冲液A2 20mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液(pH6.8)泵B 有机溶剂B2 乙腈/甲醇=50：50色谱柱：4 Shim-pack Scepter Phenyl-120分析条件：时间程序：B浓度 5%(0 min)→ 80% (8.01-11 min)→5%(11.01-15min)流速 ： 0.7mL/min进样量 ：1.0uL柱温 ：40°C检测 ： Max plot 220-400 nm (SPD-M40) 3-7. 优化阶段 在筛选阶段考察水相缓冲液的 pH 值和色谱柱种类后，通过考 虑有机流动相的混合比(30、40、50、60、70%)、柱温箱温度(35、40、45℃)和梯度程序的最终浓度(75、80、85%)等参数，进一步优化分析条件。设计空间显示了这些参数对分离的影响，纵轴为有机流动相的混合比，横轴为柱温箱温度。 构建设计空间使得能够全面可视化参数对最小分离度的影响。 LabSolutions MD可以在设计空间的整个区域(图7中的黑色方框)中预测最佳的条分析件，而不依赖于用户经验。根据设计空间，确定最佳的分析条件是有机溶剂混合比为50%，柱温箱温度为 39℃，梯度程序的最终浓度为80%。此外，通过点击设计空间中 的任意点(如图7中的点A)， 可以显示模拟的色谱图(图8)。色谱模拟功能可以在不运行任何分析的情况下，快速模拟不同分 析条件下化合物的分离情况。 图7 最小分离度的设计空间(最终梯度浓度为80%)*流动相BA：乙腈 图8 A点的模拟色谱图和实际色谱图(图7) 3-8. 使用峰跟踪自动鉴别化合物 当流动相、柱温箱温度、泵梯度程序等分析条件改变时，每种 化合物的保留时间也可能不同。通过所有获得的数据人工鉴别 种化合物是一个耗时的过程。LabSolutions MD 可通过峰跟踪功 能自动鉴别所有数据中的目标化合物(图9)。例如，紫外光谱、峰面积和其他参数的相似性可用于自动跟踪每种化合物，有助于 通过所有数据快速识别峰，无需任何额外的人工工作。 图9 使用峰跟踪功能自动鉴别目标化合物 3-9. 优化结果 表4显示了通过优化阶段确定的条件。通过构建设计空间，确定最佳条件为：50：50乙腈/甲醇作为有机相，柱温箱温度为 39℃，梯度程序的最终浓度为 80%。在3.10的验证阶段，当每 个参数在小范围内变化时，通过检查分离模式评估优化方法的耐 用性。 表4优化条件 流动相： 泵A 缓冲液 A2 20mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液(pH6.8) 泵B 有机溶剂 B2 乙腈/甲醇=50：50 色谱柱： 4 Shim-pack Scepter Phenyl-120 (100mm ×3.0mm 内径， 1.9pm) 分析条件： 时间程序：B浓度 5%(0 min)→80%(8.01-11 min)→5%(11.01-15 min) 流速 ： 0.7mL/min 进样量 ：1.0uL 柱温 ：39°C 检测 ： Max plot 220-400 nm (SPD-M40) 3-10.验证阶段 在验证阶段， LabSolutions MD 可以创建序贯实验设计来执行 耐用性评估。耐用性评估对于研究参数变化如何影响结果以及确 保方法的可靠性非常重要。 LabSolutions MD 通过在小范围内改 变优化方法的参数来自动创建序贯实验设计，以评估耐用性。具 体来说，有机流动相的混合比改变1%(49、50、51%)，柱 温箱温度改变1℃(38、39、40℃) (图10中的白色圆圈)，以验证对分离的影响。图11显示了耐用性评估获得的色谱图。参数变化对分离的影响非常小，表明了由设计空间构建的优化方 法的耐用性良好。基于 AQbD 方法的优化分析方法将有利于下一 阶段的方法开发。 图10 耐用性允差范围 4：甲氧氯普胺 11：盐酸罂粟碱 5：(S)-(+)-萘普生 12：利多卡因 图11 每个数据点的耐用性评估色谱图(图10中的白色圆圈) 用户服务热线电话： 800-810-0439 免责声明： *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 如有变动，恕不另行通知。