LC-MS/MS检测雷尼替丁中11种亚硝胺基因毒性杂质

本实验利用岛津超高效液相色谱质谱联用仪LCMS-8050建立雷尼替丁胶囊中11种亚硝胺类基因毒性杂质的检测方法，该方法采用外标法定量，验证数据表明：该方法线性、重复性、加标回收率良好，方法准确可靠，可用于雷尼替丁胶囊中11种亚硝胺类遗传毒性杂质的测试，供相关人员参考。SSL-CA23-219 Excellence in ScienceLCMSMS-790 LC-MS/MS 检测雷尼替丁中11种亚硝胺基 因毒性杂质 LCMSMS-790 摘要：本文利用岛津三重四极杆液质联用系统建立了雷尼替丁胶囊中11种亚硝胺类遗传毒性杂质的检测方法。该方法采用外标法定量，在1-500 ng/mL 的范围内，11种亚硝胺线性相关系数r均在0.999以上，线性良好；2ng/mL标准溶液连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在0.02~0.26%和2.28~7.47%之间，重复性良好；雷尼替丁胶囊平行6份加标样品加标回收率在79.5~103.88%之间，方法准确可靠，可用 于实际样品的检测。 关键词：LCMS-8050 雷尼替丁11种亚硝胺 技术特点： 必该方法将雷尼替丁中基因毒性杂质的检测种类扩展至11种。 *11种亚硝胺物质与原料药实现很好的分离，可用于准确定量。 遗传毒性杂质 (Genotoxic Impurities， GTI) 又 称基因毒性杂质，是指化合物本身直接或间接损伤细 胞 DNA， 产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能。亚硝胺类化合物 NMPA、NDELA、NPIP、NMOR、NNN、NDPA、NDBA、NDMA、NDEA、NEIPA 和 NDIPA 是常见的遗传毒性杂质。 雷尼替丁，又名呋喃硝胺，为强效组胺 H2受 体拮抗剂，能够降低胃酸和胃酶活性，是非常经典的 治疗消化性疾病药物，在我国广泛用于治疗胃及十二 指肠溃疡。2019年9月13日，FDA发表声明，提 醒患者和医护人员在雷尼替丁中发现 NDMA， FDA 发 现该致癌杂质同时会在雷尼替丁正常储存时，随着时 间的推移而含量增加，可超过人体可接受的安全限量 (96 ng/d 或 0.32 ppm)，因此建立雷尼替丁中基因 毒性杂质检测方法对药品监管和用药安全有着重要的 现实意义。 目前中检院已发布替丁类药物检测推荐方法，本 文参考中检院推荐分析方法，采用岛津三重四极杆液 质联用仪 LCMS-8050，建立了雷尼替丁中11亚硝酸 胺类基因毒性杂质的分析方法，供相关检测人员参考。 1.1仪器 岛津三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为： 系统控制器：CBM-20A 脱气机：LDGU-20A5R 输液泵：LC-30AD×2自动进样器：SSIL-30AC 柱温箱：CTO-30A质 谱 仪： LCMS-8050 流路切换阀：FFCV-20AH 检 测 器： SPD-M20A 色谱工作站：LLabSolutions 5.114 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱 柱：ACE EXCEL 3 C18-AR (150mm×4.6 mml.D.，3 um) 流 动 相：A-0.1%甲酸水；B-0.1%甲酸甲醇 流 速：0.8mL/min 柱 温：440°℃ 进样体积：5ul 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为5%，阀初始位置0位，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.8 控制器 Event 1* 1.0 泵 B.Conc 5 2.0 泵 B.Conc 8 6.5 泵 B.Conc 8 7.5 控制器 Event 0* 10.0 泵 B.Conc 35 11.0 泵 B.Conc 60 12.0 控制器 Event 1* 18.0 泵 B.Conc 100 18.0 控制器 Event 0* 21.0 泵 B.Conc 100 21.1 泵 B.Conc 5 26.0 控制器 Stop 注：“0”表示流路切换至废液， “1”表示进质谱。 质谱条件： 离子子源：APCI(+) 接口电压：4.5kV 接口温度：300℃ 加热块温度：200°℃ 雾化气流速：3.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：5.0L/min MRM 参数：见表2 DL温度：1180°℃ 表2MRM 优化参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 1 N-亚硝基二甲胺 62-75-9 74.95 42.95* -13.0 -20.0 -15.0 (NDMA) 58.20 -12.0 -14.0 -24.0 2 N-亚硝基二乙胺 55-18-5 103.00 75.10* -12.0 -14.0 -29.0 (NDEA) 47.00 -11.0 -16.0 -16.0 3 N-亚硝基-N-乙基异丙胺 16339-04-1 117.00 75.00* -13.0 -12.0 -27.0 (NEIPA) 47.20 -13.0 -15.0 -19.0 4 N-亚硝基二异丙胺 601-77-4 131.00 89.30* -10.0 -11.0 -18.0 (NDIPA) 47.10 -10.0 -14.0 -18.0 5 N-亚硝基二正丁胺 924-16-3 159.30 56.95* -12.0 -14.0 -22.0 (NDBA) 102.90 -11.0 -13.0 -17.0 6 N-亚硝基二乙醇胺 116-54-7 135.20 74.10* -15.0 -13.0 -28.0 (NDELA) 56.15 -15.0 -23.0 -21.0 7 (2S)-N-亚硝基降烟碱 16543-55-8 178.10 147.85* -20.0 -13.0 -14.0 (NNN) 20.10 -21.0 -17.0 -21.0 8 N-亚硝基吗啉 59-89-2 117.05 85.15* -23.0 -14.0 -17.0 (NMOR) 45.10 -13.0 -19.0 -18.0 LCMSMS-790 9 N-亚硝基哌啶(NPIP) 100-75-4 115.10 69.20*41.10 -12.0 -16.0 -27.0 -12.0 -22.0 -16.0 10 N-亚硝基二正丙胺 (NDPA) 621-64-7 131.15 89.05* 43.15 -14.0 -11.0 -17.0 -14.0 -12.0 -17.0 11 N-甲基-N-亚硝苯胺(NMPA) 614-00-6 137.20 66.10*107.00 -15.0 -22.0 -28.0 -15.0 -15.0 -20.0 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 用水将11种亚硝胺中间液逐级稀释为 1、2、5、10、50、100、500 ng/mL 的标准系列工作溶液。 1.4样品前处理方法 称取本品内容物适量，约相当于雷尼替丁 300 mg， 至 15 mL的离心试管中，精密加入水10 mL， 涡旋混匀 1分钟，再振摇40分钟，10000 r/min 离心10分钟，取上清液过滤后上机分析。 ■结果与讨论 2.1标准品 MRM 色谱图与雷尼替丁UV图 为避免高浓度的雷尼替丁进入仪器污染质谱，实验中通过调整液相洗脱程序，实现11种亚硝胺同雷尼替丁 色谱分析，具体结果如图1所示：0.8-7.5 min 切入质谱，监控MDELA、NDMA、NNN、NMOR， 7.5-12.0 min 为雷尼替丁出峰时间，切入废液，12.0-18.0 min切回质谱，监控其他亚硝胺。由于不同系统出峰时间会有所差别，建议配置紫外检测器进行色谱图的监控，以便重新调整流路切阀时间。 图1 标准品(50ng/mL) MRM色谱图(上)与雷尼替丁UV图 (下) LCMSMS-790 2.2校准曲线 取1.3中的标准系列工作溶液，按照1.2分析条件上机分析。以各化合物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法绘制校准曲线，具体结果见图2与表3。 Are A DMPA MDELA NPIP 1.6e 3846 -2930.488x+ 510.9592 ym7169.461x+547.0938 3806 -7557.254x+1320.275 图2 11种亚硝胺校准曲线 LCMSMS-790 表33标准曲线与检出限信息 NO. 化合物名称 校准曲线 相关系数R 准确度(%) 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 1 NMPA v=2930.49x+510.959 0.9992 95.5-106.0 0.16 0.49 2 NDELA v=7169.46x+547.094 0.9998 97.4-102.5 0.08 0.26 3 NPIP v=7557.25x+1320.28 0.9999 98.1-101.3 0.57 1.74 4 NMOR v=2649.98x+221.956 0.9999 98.3-101.0 0.17 0.53 5 NNN v=15123.4x+55.9807 0.9998 97.3-101.5 0.06 0.19 6 NDPA v=6492.65x-211.559 0.9993 97.0-106.1 0.27 0.83 7 NDBA v=6930.21x+2962.52 0.9997 98.4-103.3 0.13 0.40 8 NDMA v=4166.22x+2575.93 0.9995 96.2-104.4 0.25 0.76 9 NDEA v=4122.41x+32.9777 0.9997 97.7-102.5 0.35 1.06 10 NEIPA y=14136.0x-132.829 0.9996 96.4-103.9 0.01 0.03 11 NDIPA v=4103.51x+1315.74 0.9997 97.7-102.7 0.01 0.03 2.3重复性 取浓度为 2 ng/mL标准溶液连续6次进样，考察重复性，保留时间 RSD% 在 0.02~0.16%间，峰面积的 RSD% 在2.28~7.47%间；具体如下表。 表4重复性结果(n=6) NO. 化合物名称 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 1 NMPA 0.02 2.60 2 NDELA 0.12 3.54 3 NPIP 0.02 4.83 4 NMOR 0.09 3.82 5 NNN 0.26 2.28 6 NDPA 0.03 7.47 7 NDBA 0.02 2.45 8 NDMA 0.16 3.06 9 NDEA 0.05 4.69 10 NEIPA 0.02 6.07 11 NDIPA 0.03 5.92 2.4加标回收实验 按照1.4步骤制备雷尼替丁样品和加标样品，加标浓度为 10 ng/mL， 加标样品平行处理6份，加标回收结 果见表5。结果表明，加标回收率在 79.5~103.88%之间，平行六份样品的相对标准偏差 (RSD%) 在2.25~5.09%之间。 LCMSMS-790 表5加标回收率结果(n=6) NO. 化合物名称 样品浓度 (ng/mL) 加标浓度 (ng/mL) 加标测定结果 (ng/mL) 回收率% RSD% 1 NMPA N.D. 10.756 11.173 103.88 4.85 2 NDELA 0.969 10.418 10.747 101.41 3.40 3 NPIP N.D. 9.798 9.871 91.77 3.95 4 NMOR N.D. 10.74 10.780 100.22 3.76 5 NNN N.D. 10.195 8.551 79.5 3.94 6 NDPA N.D. 9.87 9.551 88.8 5.09 7 NDBA 0.054 10.692 10.643 98.95 3.68 8 NDMA 1.736 9.966 10.587 98.43 2.25 9 NDEA N.D. 10.531 9.609 89.33 3.07 10 NEIPA N.D. 10.12 9.205 85.58 4.01 11 NDIPA N.D. 10.165 9.183 85.37 2.91 注：N.D.表示未检出。 结论 本实验利用岛津超高效液相色谱质谱联用仪 LCMS-8050 建立雷尼替丁胶囊中11种亚硝胺类基因毒性杂质 的检测方法，该方法采用外标法定量，验证数据表明：该方法线性、重复性、加标回收率良好，方法准确可靠，可用于雷尼替丁胶囊中11种亚硝胺类遗传毒性杂质的测试，供相关人员参考。 岛津应用云