脂质体中mRNA检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-692Excellence in Science Excellence in ScienceLC-258 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 岛津生物兼容液相Nexera Bio 联合蒸发光散射检测器测定mRNA 递送介质 DMG-PEG2000的含量 LC-258 摘要：本文采用岛津生物兼容液相 Nexera Bio， 建立了 mRNA 递送介质 DMG-PEG2000 脂质体含量测定的方法。该方法中， DMG-PEG2000 在5~200 pg/mL范围内线性良好，相关系数为 0.9982。精密度实验中，DMG-PEG2000 的保留时间 RSD% 为 0.06-0.20%，峰面积RSD% 为 0.56-2.14%。实验结果表明，该方法能快速准确地测定 DMG-PEG2000 脂质体的含量。 mRNA是带有负电荷的长链大分子，而细胞膜表面也带有负电荷，静电排斥使得 mRNA分子较难穿过细胞膜进入细胞内。并且，因为 mRNA 分子是单链，本身极其脆弱，体内的多种酶都能将它迅速降解。mRNA 编码信息中涵盖了核糖体生成蛋白的序列，必须递送至细胞内才能编码蛋白。因此需要合适的递送介质将 mRNA 递送到细胞内部。 mRNA 疫苗/药物递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体以慢病毒、腺相关病毒、仙台病毒等载体为主的病毒载体虽能进行核酸递送，但可能会因载体引起的免疫反应而受到限制，影响其应用。而非病毒载体主要包括脂质体、树突细胞、无机纳米粒子、阳离子细胞穿膜肽等。目前，脂质载体已成为递送 mRNA 最为有效的非病毒载体。目前，用于递送mRNA的非病毒载体中以脂质体应用的最为广泛，主 要包括阳离子脂质体复合物、脂质体聚合物、脂质体纳米粒、阳离子纳米乳等。 DMG-PEG2000(1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)是一种新型的 mRNA 疫苗/药物阳离子脂质体递送介质，随着新冠疫苗的火热研制而迅速蹿红被大家认识，该材料是通过 PEG 化修饰了一种短链脂质， DMG-PEG2000 的短链(肉豆蔻酸，C14)比DSPE-mPEG2000 长链(硬脂酸，C18)半衰期小可更快降解，可降低脂质体与细胞间的相互作用。 DMG-PEG2000 的含量检测会对优化 mRNA 药物的给药方式，药效研究等具有重要意义。 本实验使用生物兼容液相 Nexera Bio 联合蒸发光散射器建立了 mRNA 递送介质 DMG-PEG2000 的含量测定方法，该方法分析速度快，准确度好。 实验部分 1.1仪器 生物兼容液相系统 Nexera Bio， 配置信息如下： 系统控制器：CBM-20A 自动进样器： SIL-20ACXR 输液泵：LC-20AD XR 脱气机： DGU-20A3R 检测器： ELSD-LTⅡ 色谱工作站：Labsolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack Scepter C4-300 (50 mm ×2.1 mm1.D.， 1.9um， 岛津(上海)实验器材有限公司，P/N：227-31175-03) 流动相A： 10 mmol三乙胺乙酸 (TEAA) 水溶液 (pH7.0) 流动相B： 10mmol三乙胺乙酸 (TEAA) 甲醇溶液(pH7.0) 流速：0.5mL/min 柱温：55C 进样体积： 10uL 雾化气：350MPa 检测器温度：40℃ 检测器增益：4(x8) 洗脱方式：梯度洗脱，B相起始浓度为70%，时间程序如表1所示。 表1梯度洗脱时间程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 2.00 泵 B Conc 70 6.00 泵 B Conc 100 14.00 泵 B Conc 100 14.10 泵 B Conc 70 18.01 控制器 Stop 1.3流动相和标准品配制 流动相A：取10mmol的三乙胺于适量水中，用乙酸调节 pH至7.0，后稀释至1000mL混匀，超声脱气即得；流动相B：取10 mmol的三乙胺于适量甲醇中，用乙酸调节pH至7.0，后稀释至1000mL混匀，超声脱气即得； 对照品储备液制备：称取标准品5.09 mg，用水溶解稀释成5mg/mL； 利用对照品储备液配制线性标曲，浓度分别为5， 10， 20，50， 100， 200 ug/mL。 结果与讨论 2.1标准曲线 图1DMG-PEG2000 对照溶液(5~200 ug/mL)图谱(左)和 DMG-PEG2000标准曲线(右) 按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用外标法建立指数标准曲线，结果如图2所示， DMG-PEG2000 在 5-200 ug/mL线性浓度范围内，线性相性性良好，相关系数为0.9982，准确度为89.3~114.2%(图1)。 2.2精密度实验 按照1.2分析条件测定，选择浓度为5、20和200 ug/mL的DMG-PEG2000对照品溶液分别连续进样测定6次。DMG-PEG2000的保留时间 RSD% 为 0.06-0.20%；峰面积RSD%为 0.56-2.14%，结果见表2所示。实验结果表明，生物兼容液相系统 Nexera Bio 具有良好的精密度。 表2DMG-PEG2000 对照品溶液精密度实验结果(n=6) 序号 5 ug/mL 50pg/mL 200ug/mL R.T. Area R.T. Area R.T. Area 5.285 667 5.252 48670 5.234 325037 2 5.279 638 5.255 47057 5.217 325328 3 5.269 636 5.256 49066 5.231 328397 4 5.271 648 5.256 47926 5.242 324382 5 5.275 641 5.257 49793 5.242 324062 6 5.297 626 5.262 47763 5.246 327871 平均值 5.279 643 5.256 48379 5.235 325846 RSD(%) 0.20 2.14 0.06 2.04 0.20 0.56 2.3样品含量测定 将供试品 mRNA疫苗制剂利用纯水稀释50倍后进样分析，结果如表3所示。最终终算样品中DMG-PEG2000 的含量为1760 ug/mL。 图2稀释后供试品溶液色谱图 表3mRNA疫苗制剂中 DMG-PEG2000 含量测定结果 化合物名称 保留时间 峰面积 稀释后浓度 (ug/mL) 样品中 DMG-PEG2000 含量 (pg/mL) DMG-PEG2000 5.236 21717 35.200 1760 结论 本实验使用岛津生物兼容液相系统 Nexera Bio 联合蒸发光散射检测器，建立了DMG-PEG2000 的含量测定方法。结果表明， DMG-PEG2000 在5~200 ug/mL线性范围内线性良好，相关系数为0.9982。精密度实验中，连续进样6针， DMG-PEG2000 的保留时间 RSD 为 0.06-0.20%；峰面积 RSD 为 0.56-2.14%，仪器精密度良好。该实验方法分析速度快，准确性好。 岛津应用云 本实验使用岛津生物兼容液相系统Nexera Bio联合蒸发光散射检测器，建立了DMG-PEG2000的含量测定方法。结果表明，DMG-PEG2000在5~200 μg/mL线性范围内线性良好，相关系数为0.9982。精密度实验中，连续进样6针，DMG-PEG2000的保留时间RSD为0.06-0.20%；峰面积RSD为0.56-2.14%，仪器精密度良好。该实验方法分析速度快，准确性好。