卡培他滨中对甲苯磺酸甲酯检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-487Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-545 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定药物中对甲苯磺酸甲酯的含量 LCMSMS-545 摘要：本文建立了一种使用岛津超超效液相三重四极杆质谱仪联用系统测定药物中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯含量的方法。此方法在5min 内可完成对甲苯磺酸甲酯的分析，校准曲线的相关系数在0.998以上，线性范围为0.2-200 ng/mL。 对 0.2 ng/mL标准溶液平行测定6次，对甲苯磺酸甲酯标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别为 0.365%和4.00%，仪器精密度良好。对于加标浓度为 0.5 ng/mL， 50 ng/mL 和 150 ng/mL的样品，各平行测定3次，回收率在94.8%-101.75%之间。该方法可应用于药品中对甲苯磺酸甲酯含量的快速检测。 关键词：三重四极杆液质谱仪对甲苯磺酸甲酯遗传毒性杂质 基因毒性杂质(genotoxic impurity， GTI))又称遗传毒性杂质，是指化合物本身直接或间接损伤细胞DNA， 产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能性。对甲苯磺酸甲酯 (methyl p-toluenesulfonate， MTS)是一种具有潜在基因毒性的杂质(图1)。主要由于在药物的合成中使用的对甲苯磺酰氯或对甲苯磺酸在工艺中未完全除去，导致易与后续合成反应中使用的有机溶剂甲醇反应生成对甲苯磺酸甲酯物质。近几年来各国的法规机构如人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)、FDA、EMA 等均对基因毒性杂质有了更明确要求，严格控制基因毒性杂质的毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC) 限度为1.5 ug/d，因此在药品生产过程中付甲苯磺酸甲酯基因毒性杂质的含量监测具有重要的意义。 液相色谱串联质谱法技术具有灵敏度高、分析速度快、结果准确可靠的优点，，可满足痕量毒性杂质的检测要求。本研究使用岛津超高效液相色谱仪LC-20ADXR和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统测定卡培他滨样品中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯的含量。 图1对甲苯磺酸甲酯(Methyl p-toluenesulfonate) 系统控制器：CBM-20A脱气机： DGU-20A输液泵： LC-20ADXR×2自动进样器： SIL-20ACXR柱温箱： CTO-20AC液相检测器： SPD-M20A色谱工作站： LabSolutions Ver.6.84质谱仪： LCMS-8050 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH 2.1 mm l.D.× 50 mm L.，1.7 um 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-甲醇 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：10uL 洗脱方式：等度洗脱，45%BB(v/v)。 质谱条件 离子源： ESI* 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min加热气流速：10L/min接口温度：200℃ 干燥气流速： 10L/min 喷针位置：+4mm 驻留时间：100ms DL温度：250℃ MRM参数：见表1 表1MRM优化参数 编号 名称 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 65.00* -13.0 -20.0 -15.0 1 对甲苯磺酸甲酯 80-48-8 187.00 91.00 -13.0 -39.0 -28.0 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 称取对甲苯磺酸甲酯标准品适量，用甲醇溶解、配制成 1.0 mg/mL 的标准储备液，置于-18℃冰箱中保存。取准确体积的标样储备液，使用初始流动相依次配制成 0.2 ng/mL， 0.5 ng/mL， 1 ng/mL， 10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL， 200 ng/mL 浓度的标准工作液。 1.4样品前处理方法 精确称取试样5.0g(精确到0.1g)，加入45%甲醇水溶液((v/v)溶解，后置于50 mL容量瓶中定容，并逐级稀释至浓度为 5 mg/mL的溶液，溶液经0.22 um 滤膜过滤后得待测溶液，然后将待测溶液进液相色谱-串联质谱进行测定。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 对甲苯磺酸甲酯，按照常规质谱条件， M+H峰很难出现，加钠峰很高，当喷针位置调到+3 mm 以上时，以 M+H 峰为主。如下图2所示， MS图和 MS²的碎片谱图。 图22对甲苯磺酸甲酯MS和MS²的质谱图 2.2对甲苯磺酸甲酯标准溶液的 MRM 色谱图 1.47e3 图3 0.2 ng/mL对甲苯磺酸甲酯及空白溶液的 MRM 色谱图 2.3线性范围 使用初始流动相依次配制成 0.2 ng/mL， 0.5 ng/mL， 1 ng/mL， 10 ng/mL， 50 ng/mL， 100 ng/mL， 200ng/mL 浓度的标准工作液。以工作溶液浓度为横坐示，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线(见下图5)，所得校准曲线线性关系良好，相关系数大于0.998，且准确度在92.2%-103.4%之间(见图4)。 # Data Filename Sample Type Level Found RT Area Conc.(ng/mL) S/N Std. Conc. (ng... Accuracy(9) Y Y Y Y Y Y 回1 20190109-01-STD-0.2ng Standard 1 2.836 3483 0.2068 20.75 0.2000 103.42 2 20190109-01-STD-0.5ng Standard 2 2.814 7964 0.4761 50.25 0.5000 95.22 3 20190109-01-STD-1ng Standard 3 2.829 15387 0.9221 62.58 1.0000 92.21 回4 20190109-01-STD-10ng Standard 4 2.833 169487 10.1816 348.16 10.0000 101.82 5 20190109-01-STD-50ng Standard 5 2.842 837408 50.3151 438.83 50.0000 100.63 6 20190109-01-STD-100ng Standard 6 2.849 1718428 103.2533 501.04 100.0000 103.25 团7 20190109-01-STD-200ng Standard 7 2.833 3443351 206.8992 482.56 200.0000 103.45 图4对甲苯磺酸甲酯 0.2-200 ng/mL标曲数据及准确度 图5对甲苯磺酸甲酯 0.2-200 ng/mL线性方程 2.4重复性考察 按照1.3步骤配制0.2 ng/ml浓度标准溶液，连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下图6所示。标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别为 0.365%和4.00%，仪器精密度良好。 # Data Filename Sample Type Level Found RT Area Conc.(ng/mL) S/N 1 2019010-LOQ-0.2ng-re-... Control 1 2.843 3790 0.2253 22.09 2 20190109-LOQ-0.2ng-re... Control 1 2.848 3579 0.2127 17.55 回3 20190109-LOQ-0.2ng-re... Control 1 2.827 3744 0.2225 15.61 回4 20190109-LOQ-0.2ng-re... Control 1 2.820 3961 0.2356 20.20 5 20190109-LOQ-0.2ng-re... Control 1 2.835 3817 0.2270 15.08 6 20190109-LOQ-0.2ng-re... Control 1 2.829 3540 0.2103 17.98 Average 2.834 3739 0.2222 18.09 %RSD 0.365 4 4.2437 14.84 Maximum ---- ---- ---- 2.848 3961 0.2356 22.09 Minimum -- -- ---： 2.820 3540 0.2103 15.08 Std.Dev. ---- ---= ---： 0.010 157 0.0094 2.68 图60.2 ng/mL重复性测试 (n=6) 2.5灵敏度实验 配制0.2 ng/mL对甲苯磺酸甲酯标准溶液进样，为考察仪器的灵敏度，将低浓度标准工作液按1.2中的分析条件下进行测定。通过 LabSolutions Ver. 6.84 软件计算信噪比(采用RMS 计算方式)，检出限和定量限，化合物的平均信噪比为18.09，平均定量限为 0.12 ng/mL，平均检测限为 0.04 ng/mL。 2.6回收率实验 按照1.4中样品制备方法，加标浓度为0.5 ng/mL、50 ng/mL 和150 ng/mL，各平行测定3次。测试结果显示：对甲苯磺酸甲酯样品的加标回收率在94.8%-101.75%之间，结果如表2。 表2 回收率实验结果 名称 加标浓度 0.5 ng/mL 加标浓度 50 ng/mL 加标浓度150 ng/mL 检测值 回收率 检测值 回收率 检测值 回收率 (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) Repeat-01 0.479 95.8 50.214 100.43 151.766 101.18 Repeat-02 0.497 99.4 50.865 101.73 152.581 101.72 Repeat-03 0.474 94.8 50.875 101.75 151.317 100.88 2.7样品检测 图7755mg/mL供试样品对甲苯磺酸甲酯含量色谱图(5 min 后主成分切入废液) 取样品适量，精密称定，加入45%甲醇水溶液(v：v)溶解并稀释制成浓度约为 5 mg/mL的溶液，作为待测的供试品溶液，如图7所示，样品中未检出对甲苯磺酸甲酯。 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-20ADXR 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定药物中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯的残留方法。该方法校准曲线的相关系数均在0.998 以上。0.2 ng/mL对甲苯磺酸甲酯标准溶液平行测定6次，保留时间和峰面积的RSD% 分别为 0.365% 和4.000%，重现性良好。对于加标浓度为0.5 ng/mL， 50 ng/mL和150 ng/mL的样品，各平行测定3次，加标回收率在94.8%-101.75%之间。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的优势，可用于药品中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯的残留检测。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-20ADXR和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定药物中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯的残留方法。该方法校准曲线的相关系数均在0.998以上。0.2   ng/mL对甲苯磺酸甲酯标准溶液平行测定6次，保留时间和峰面积的RSD%分别为0.365%和4.000%，重现性良好。对于加标浓度为0.5   ng/mL，50 ng/mL和150 ng/mL的样品，各平行测定3次，加标回收率在94.8%   -101.75%之间。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的优势，可用于药品中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯的残留检测。