美罗培南中NDMA检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-476Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-540 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法检测美罗培南中的遗传毒性杂质 NDMA LCMSMS-540 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪检测美罗培南原料药中遗传毒性杂质NDMA 的方法。本方法采用外标法定量，定量限为 0.02 ppm， 线性相关系数大于0.999。对1ng/mL的标准溶液重复进样六针，保留时间和峰面积的相对标对偏差分别为0.08%和5.51%。美罗培南原料药三个不同浓度样品加标回收率在91.9~107.8%之间，，平行处理三次的相对标准偏差在1.89~5.12%之间。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱亚硝胺类化合物遗传毒性杂质 ppm (按每日服用320mg沙坦类药物计算)。 美罗培南，或译美洛培南，是一种有非常广泛抗菌性及可供注射的抗生素，用于治疗多种不同的感染，包括脑膜炎及肺炎。它是一种β内酰胺类抗生素，属于碳青霉烯的分类下。由于其属于容易降解产生 NDMA的药物，所以药物生产过程中须检测评估 NDMA。 目前 FDA 和 EDQM均已公布NDMA单独测定的LC-MS/MS分析方法，本文参考以上分析方法，使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8060，建立了测定美罗培南原料药中亚硝基类化合物 NDMA的方法，供相关检测人员参考。 脱气机： DGU-20A5R 输液泵：LC-30AD×2自动进样器：SIL-30ACMP柱温箱： CTO-30A色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99质谱检测器： LCMS-8060切换阀：FCV-12AH 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： ACE C18-AR， 100 mm×4.6 mm l.D.， 3 um 流动相：A-0.1%甲酸；B-甲醇 洗针模式：进样前后洗针， External only (进样针外壁清洗)， Rinse Port 流速：0.8mL/min柱温：40℃进样体本：20uL洗针液：甲醇/水=1：11(v：v) 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为1%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 1** 3.00 Pumps Pump B Conc. 20 5.50 Oven CTO.RVR 0* 7.00 Pumps Pump B Conc. 90 9.00 Pumps Pump B Conc. 90 9.10 Pumps Pump B Conc. 1** 14.00 Controller Stop 注：*“0”表示流路切换至废液；** “1”表示流路切换至质谱。 质谱条件 离子化模式： APCI， 正离子模式 雾化气流速：4.2L/min 接口温度：300℃ DL温度：180℃ 加热模块温度：200℃干燥气流速：15.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)接口电压：4.5KV 碰撞气：氩气270 kPa MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 中文名称 英文名称 缩写 CAS 号 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) N-亚硝基 N-Nitrosodi- NDMA 62-75-9 75.10 58.10* -14.0 -17.0 -24.0 二甲胺 methylamine 42.95 -29.0 -18.0 -16.0 *代表定量离子对。 1.3标准溶液配制 取 NDMA 混合标准贮备液(10 mg/L)， 以30%甲醇逐级稀释为0.3、0.4、0.5、1、2、5和10ng/mL 的标准溶液，直接进样分析。 1.4样品前处理 准确称取 150 mg 美罗培南粗品至塑料离心管中，先加入3mL甲醇，超声至原料药完全溶解，再用超纯水定容至10mL，涡旋混匀经0.22 um 滤膜过滤，取滤液上机检测。 结果与讨论 2.1标准样品色谱图 图1 0.3 ng/mL标准样品 MRM 色谱图(S/N=10.73， ASTM) 2.2线性关系 按照1.3配制七个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。使用 Labsolutions 软件(Ver.5.99)选择外标法进行定量。NDMA标准曲线见图2，线性方程、相关系数和方法定量限(S/N=10，以ASTM方式计算)见表3. 图2 NDMA标准曲线 表3 线性关系和定量限 名称 定量方法 校准曲线 线性范围 准确度 相关系数 定量限 (ng/mL) (%) 厂 *(ppm) NDMA 外标法 Y=13584.14X-31.50881 0.3~10.0 92.6~106.6 0.9990 0.02 注：*按照样羊15 mg/mL的配制浓度计算转换。 2.3精密度实验 对1ng/mL的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如表4所示。该浓度下标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差为0.087%和5.511%，仪器精密度良好。 2.4加标回收实验 在美罗培南原料药样品中添加三个不同浓度的标准溶液，每个浓度的加标样品平行处理三份，加标回收结果见表5。三个不同浓度加标回收率在91.9~107.8%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.89~5.86%之间，方法准确可靠。 表5样品加标回收率(n=3) 化合物名称 0.3 ng/mL 1.0 ng/mL 5.0ng/mL 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% NDMA 91.9 5.31 98.2 5.86 107.8 1.89 2.5 专属性实验 高浓度标准样品(10 ng/mL)分析完成后，进样空白溶剂，考察残留及专属性情况。结果表明，如图3所示，目标保留时间处， NDMA检测通道中无明显干扰。 图3 标准样品(5ng/ml)和空白样品叠加色谱图(蓝线：标准样品；绿线：空白样品) 2.6实际样品测试 将原料药按1.4步骤平行处理三份，上机分析，样品中均未检出 NDMA， 实际样品色谱图见图4。 图4 实际样品检测 MRM 色谱图 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定美罗培南原料药中遗传毒性杂质 NDMA的方法。使用Labsolutions软件(Ver.5.99)实现外标法定量，定量限分别为 0.02ppm，线性相关系数不低于0.999，满足限量标准要求， 1 ng/mL基质混合标准平平行测试6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差为 0.087% 和5.511%。本方法线性范围宽、重复性好、准确度高、前处理简单，适合用于遗传毒性杂质 NDMA 的定量检测。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪检测美罗培南原料药中遗传毒性杂质NDMA的方法。本方法采用外标法定量，定量限为0.02   ppm，线性相关系数大于0.999。对1 ng/mL的标准溶液重复进样六针，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.08 %和5.51   %。美罗培南原料药三个不同浓度样品加标回收率在91.9~107.8%之间，平行处理三次的相对标准偏差在1.89~5.12%之间。