珍珠龙胆石斑鱼中蛋白质和脂肪含量的检测

珍珠龙胆石斑鱼CO2麻醉无水保活效果的因素影响广东海洋大学学报Journal of GuangdongOceanUniversity第 41卷第 6期2021年 11月Vol.41No.6Nov. 2021 第 41卷广东海洋大学学报74 范秀萍，张家胜，郭侨玉，等 .珍珠龙胆石斑鱼 CO2麻醉无水保活效果的因素影响 [J].广东海洋大学学报，2021，41（6）：73-81. 珍珠龙胆石斑鱼 CO2麻醉无水保活效果的因素影响 范秀萍 1,2，张家胜 1，郭侨玉 1，杜欢 1，秦小明 1,2，刘书成 1,2 （1.广东海洋大学食品科技学院 //广东省水产品加工与安全重点实验室 //广东省海洋食品工程技术研究中心 //水产品深加工广东 普通高等学校重点实验室，广东湛江，524088；2.南方海洋科学与工程广东省实验室，广东湛江，524025） 摘要 ：【目的】研究二氧化碳（CO2）对珍珠龙胆石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus laceolatus ♂)的麻醉效果，并探讨无水保活技术对石斑鱼运输的影响。【方法】以麻醉和复苏时间、无水保活时间和存活率为 指标，探讨温度、CO2浓度、麻醉时间、保活温度对珍珠龙胆石斑鱼 CO2麻醉后无水保活效果的影响；并对 CO2麻醉无水保活过程中的鱼体血清生化、游离氨基酸和基本营养成分进行分析。【结果】珍珠龙胆石斑鱼（503.0±37.0）g 在 25 ℃海水中暂养 24 h 后，逐渐降温至 18 ℃，在含 CO2质量浓度 125mg/L （pH 5.8）的海水中麻醉 5min ，转移至 15 ℃、充氧保湿的无水条件下保活，11 h 后的存活率达到 83.3%。低温 CO2麻醉与无水保活过程中 鱼体代谢发生变化：谷丙转氨酶（ALT ）、谷草转氨酶（AST ）与尿素氮（BUN ）水平均显著上升 (P < 0.05)，有 水复苏 12 h 后能恢复到正常水平；出现典型的“高血糖”症状。珍珠龙胆石斑鱼经低温 CO2麻醉、无水保活胁迫 后主要表现出能量代谢的应激响应，以无氧呼吸为主，脂肪和糖原为主要能量物质；鲜味与苦味氨基酸含量显著 下降 (P < 0.05)，甜味氨基酸质量分数增加 43.52%。保活后鱼肉营养品质优于低温休眠有水保活模式。【结论】 CO2对珍珠龙胆石斑鱼有较好的麻醉作用，CO2麻醉协同低温可用于珍珠龙胆石斑鱼无水保活运输。 关键词 ：CO2麻醉；珍珠龙胆石斑鱼；无水保活；血清生化；代谢；游离氨基酸 中图分类号 ：S981.1 文献标志码 ：A 文章编号 ：1673-9159（2021）06-0073-09 doi ：10.3969/j.issn.1673-9159.2021.06.009 Effect of CO2AnesthesiaonWater-freeLive-transport of theGrouper (Epinephelus fuscoguttatus?xEpinephelus laceolatuso) FANXiu-ping1,2, ZHANG Jia-sheng1, GUOQiao-yu1, DUHuan1, QIN Xiao-ming1,2, LIU Shu-cheng1,2（1.Collegeof FoodScienceandTechnology ,GuangdongOceanUniversity //GuangdongProvincial KeyLaboratory ofAquatic Product ProcessingandSafety //GuangdongProvincial Engineering TechnologyResearchCenter of MarineFood //KeyLaboratory ofAdvancedProcessingof Aquatic Products of GuangdongHigher Education Institution ,Zhanjiang 524088,China ; 2.SouthernMarine ScienceandEngineeringGuangdongLaboratory ,Zhanjiang 524025,China ） Abstract:【Objectives 】Theanesthesia effect of carbondioxide (CO2) onwater-free transport of grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus laceolatus ♂).【Methods 】The effects of temperature, CO2concentration, anesthesia time and keeping-alive temperature on the water-free live transport alive 收稿日期：2021-05-07 基金项目：“十三五 ”国家重点研发计划重点专项项目（2019YFD0901601）；南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江）资助项目 （ZJW-2019-06）；广东海洋大学科研启动经费资助项目（060302042101）；广东海洋大学创新团队项目（CXTD2021006）；广东省大学生创新创业训练计划项目（S201910566059）。 第一作者：范秀萍（1979―），女，博士，副教授，研究方向为水产品保活流通与加工。E-mail ：fanxp08@163.com without water after CO2 anesthesia were investigated by the indexes of anesthesia time, recovery time, the live time without water and survival rate of grouper. Fish serum biochemical, free amino acids and basic nutrients during keeping-alive without water after CO2 anesthesia were also analyzed.【Results 】 After the groupers were acclimated in 25 ℃fresh marine water for 24 h , gradient cooled to 18 ℃, transferred to 18 ℃, 125mg/LCO2 solution (pH5.8) for 5 min, thenpreserved at 15 ℃ without water. The survival rate reached83.3% after 11 h. The metabolism of grouper changed during low temperature CO2 anesthesia and live preservation. Enzyme activities of glutamic-pyruvic transaminase (AST), glutamic-oxalacetic transaminase (ALT) and urea nitrogen (BUN) content were increased significantly (P < 0.05), then returned to normal level after recovery in fresh seawater. However, the animals showed a typical "hyperglycemia" symptom during anesthesia, low-temperature preservation and recovery.After CO2 anesthesia, combined with low-temperature and water-free survival stress, grouper showed the stress response of energy metabolism, mainly anaerobic respiration. Moreover, fats and glycogen were used as the main energy substances. The umami and bitter amino acid contents decreased significantly (P < 0.05), and the sweet amino acid content increased by 43.52%. The nutritional quality of fish is better than that bykeepingwith water after low-temperature hibernation.【Conclusion 】CO2 has agood anesthetic effect on grouper (E. fuscoguttatus♀×E. laceolatus ♂). CO2 anesthesia and keeping alive under low-temperature technology,canbeused for thewater-free transportationof grouper. Key words: carbon dioxide anesthesia; Epinephelus fuscoguttatus♀× Epinephelus laceolatus♂; keep-alivewithout water; serumbiochemistry; metabolism; freeaminoacid 珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus laceolatus ♂）是一种暖水性海洋鱼类 [1]，营养丰富、肉质细嫩，其鲜活产品深受消费者的青 睐 [2]。有水保活运输技术运载量低，同时水质恶化 易引起鱼体存活能力与鱼肉品质降低，且常用的化 学麻醉剂容易因残留引起食用安全问题 [3]。二氧化 碳（CO2）是一种安全无毒，价格低廉的麻醉剂 [4]。研究发现，10 ℃温度下鲫（Carassius auratus ）在 700mg/LCO2溶液中麻醉后，无水保活时间可长达 15h[5]；CO2在罗非鱼（Oreochromis mossambicus ）、鲤（Cyprinus carpio ）、鳜（Siniperca chuatsi ） 、鲑（Salmo salar ）等种类中均得到了较好的麻醉保 活效果 [6-9]。CO2进入血液，降低血 pH ，导致大脑 中 O2运输量降低，引起鱼体麻醉 [10]。但 CO2增加 会引起水体变酸，导致鱼体呼吸困难，出现死亡，且 CO2浓度随时间的延长会发生改变。低温联合低 浓度的 CO2处理麻醉鱼体，不仅能降低鱼体的新陈 代谢，还能降低鱼体由于运输所带来的应激与损 伤 [11]，具有较好的发展与应用前景。但 CO2麻醉技 术在珍珠龙胆石斑鱼中的应用尚未见相关报道。 本研究探讨 CO2对珍珠龙胆石斑鱼的麻醉效果 与无水保活的条件，研究 CO2麻醉珍珠龙胆石斑鱼 后无水保活过程中所需的适宜麻醉水温、CO2浓度、 麻醉时间和无水保活温度，并对麻醉与无水保活过 程中的生化指标、营养成分进行分析，以期为珍珠 龙胆石斑鱼的无水保活运输提供参考。 1材料与方法 1.1材料与试剂 珍珠龙胆石斑鱼（E.fuscoguttatus ♀ × E. laceolatus ♂），广东省湛江市东海岛养殖场养殖，体 质量（503.0±37.0）g 。实验前停食暂养 24h ，实 验时挑选体质健康、无外伤的珍珠龙胆石斑鱼。 谷丙转氨酶（ALT ）、谷草转氨酶（AST ）、酸 性磷酸酶（ACP ）、碱性磷酸酶（AKP ）、尿素氮 （BUN ）、糖原检测试剂盒，南京建成生物有限公 司；皮质醇：上海酶联生物科技有限公司。葡萄糖 测定试剂盒：上海荣成盛生物药业有限公司。 1.2仪器与设备 鱼类保活运输系统（定制），广州铭创生物科 技有限公司；Varioskan 全自动酶标仪，美国 ThermoFisher 公司；835-50型氨基酸分析仪，日本 日立公司；HX204卤素水分测定仪，瑞士梅特勒 -公司；Vap450全自动凯氏定氮仪，德国格哈特公司。 1.3 CO2麻醉无水保活实验方法 1.3.1麻醉和复苏阶段行为特征观察 本实验中 麻醉和复苏的分期标准参考 Erikson 等 [8]的方法，并 结合珍珠龙胆石斑鱼自身行为特征加以修改。将处 于 CO2溶液中的珍珠龙胆石斑鱼的麻醉过程分为 6个时期（表 1），复苏过程分为 4个时期（表 2）。 表 1珍珠龙胆石斑鱼麻醉程度分期及行为特征 Table 1Anesthesia stage and behavior characteristics of Epinephelus fuscoguttatus ?x Epinephelus laceolatus o 麻醉程度分期 行为特征 备注 Anesthesia stage Behavior characteristics Notes 正常期 呼吸频率正常（鳃盖振动次数恒定） A1（轻度镇静期） 静止不动，身体平衡，鳃动正常，使其平躺能迅速恢复正常状态，触觉略失 A2（深度镇静期） 静止不动，鳃动略有降低，身体平衡，触碰反应较弱或无反应，使其平躺经挣扎能恢复正常状态 用于一般运输 A3（平衡失调期） 身体左右倾斜，鱼体在水中晃动，不能翻身 A4（麻醉期） 完全失去平衡，鱼体完全翻倒（平躺水底，尾鳍与胸鳍会摆动），完全失去肌肉 张力（身体僵直） 操作最佳时期 A5（深度麻醉期） 鱼体平躺水底，静止，鳃动困难或鳃咧，立即转入清水复苏 立即复苏 A6（延髓麻醉期） 鳃盖张合停止 死亡 表 2珍珠龙胆石斑鱼复苏过程分期及行为特征 Table 2 Stages and behavior characteristics of Epinephelus fuscoguttatus?xEpinephelus laceolatus o during recovery 复苏过程分期 行为特征 Recovery stage Behavior characteristics R1 鱼体完全翻倒，呼吸恢复，鳃盖开始振动 （鱼鳍开始晃动） R2 鱼体侧躺，恢复运动(尾鳍与胸鳍摆动) R3 身体完全平衡，游动，触碰有反应，使其 平躺经挣扎能恢复正常状态 呼吸频率正常，使其平躺能迅速恢复正常 状态 R4 1.3.2 CO2麻醉水温对珍珠龙胆石斑鱼麻醉与无水 保活效果的影响 在 50L 的玻璃缸中加入 15L 海 水，放入珍珠龙胆石斑鱼，空气泵充氧保持水体溶 氧在 6.0 ~ 7.5 mg/L ，以 2 ℃/h 的速度降至实验温 度（25、22、20、18、15 ℃），以 0.5L/min 的流速 充入 CO2气体，记录水体 pH 值，采用化学滴定法 测定水体 CO2浓度、记录鱼体行为及麻醉时间。麻 醉至 A4期后转入相同温度海水中复苏，记录复苏 时间。每组 6尾鱼 。 珍珠龙胆石斑鱼经 25 ℃暂养 24h 后，在不同 温度（15、18、20、22、25 ℃）的 CO2麻醉溶液 中浸泡，当鱼体进入 A3期后，转移至内有封口袋 的保活箱中，用湿纱布包住鱼体保持湿度，充入 O2，在 15 ℃条件下无水保活，观察鱼体活动，以 鱼体僵硬、刺激无鳃动作为死亡时间。记录不同麻 醉温度浸泡后无水保活不同时间下鱼体的存活率。每组 4尾鱼。 1.3.3 CO2浓度对麻醉时间和保活时间的影响 将 暂养后的珍珠龙胆石斑鱼转移到 18 ℃不同质量浓 度的 CO2麻醉溶液（30、60、75、125mg/L ）浸泡，当鱼体进入 A3期后，转移至内有封口袋的保活箱 中，用湿纱布包住鱼体保持湿度，充入 O2，在 15 ℃条件下无水保活。观察鱼活动的变化，记录麻醉时 间、存活时间与存活率。每组 4尾鱼。 1.3.4 CO2麻醉时间对存活率的影响 将暂养后的 珍珠龙胆石斑鱼转移到相同的 18 ℃、125 mg/L CO2麻醉溶液浸泡不同时间（5、10、15、20、25min ）后，转移至内有封口袋的保活箱中，用湿纱布包住 鱼体保持湿度，充入 O2，在 15 ℃条件下无水保活。观察鱼活动变化，记录不同保活时间下的存活率。每组 4尾鱼。 1.3.5无水保活温度对存活时间与存活率的影响 珍珠龙胆石斑鱼经 25 ℃暂养 24h ，在 18 ℃、125mg/LCO2溶液中麻醉 5min ，转移到内有封口袋的 保活箱中，用湿纱布包住鱼体保持湿度，充入 O2，在不同温度（15、18、20、22、25 ℃）条件下无 水保活。记录存活时间与存活率。每组 6尾鱼。 1.4血清生化指标的检测方法 珍珠龙胆石斑鱼经 25 ℃暂养 24h 后，逐渐降 温至 18 ℃，在充 CO2（125mg/L ）海水中浸泡 5min ，转移至 15 ℃、充 O2的无水条件下保活，10h 后取 出在 25 ℃新鲜海水中复苏，复苏 12h 后的存活率 为 100%，取复苏后 12h 的鱼作为复苏组。以暂养 后的石斑鱼作为对照组、CO2麻醉后的鱼为麻醉组、无水保活 10h 为无水保活组。使用注射器尾部静脉 取血，将血液注入 1.5mL 离心管中，4 ℃静置 2~3h ，3 000 r/min 离心 10 min ，取上层血清于离心管 中，用于检测。取鱼背肌用于检测。每组 4尾鱼。 1.5游离氨基酸分析 采用日立 835-50型高速氨基酸分析仪进行测 定。测定条件：离子交换柱规格 26mm × 150mm ，交换树脂型号 NO2619（52051），柱温 53 ℃，泵流 速 0.225mL/min ，泵压力 8.8MPa ，分析时间 72min ，进样体积 50µL 。 准确称取鱼肉样品 5.00g ，加入 15mL 超纯水 后均质，以 10000 r/min 离心 10min ，取 9mL 上 清液，加入 1mL 体积分数 50%三氯乙酸溶液，用 0.5mol/LNaOH 调 pH 值至 2.0，经微孔（孔径 0.45μm ）过滤后氨基酸自动析仪检测。 1.6基本营养成分的测定 三种保活运输模式：CO2麻醉无水保活，采用 CO2麻醉后在 15 ℃下无水模拟运输；低温休眠有 水保活模式 [12]，采用梯度降温至 15 ℃，并在 15 ℃下 100g/L 的密度有水保活模拟运输 10h ；低温有 水保活运输模式，采用冰块降温至 20 ℃，并在 20℃条件下 50g/L 的密度模拟运输 10h 。 水分含量采用水分测定仪测定，粗蛋白质含量 采用全自动凯氏定氮仪（GB5009.5-2016）测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB5009.6-2016）测 定，粗灰分含量采用高温灼烧法（GB5009.4-2016）测定，糖原含量采用蒽酮 -硫酸法测定。 1.7数据处理 基本营养成分数据运用 SPSS19.0处理，结果 用平均值±标准差（X ±SD ）表示。组间差异采用 单因素方差分析（One-WayANOVA ），对于存活率 非正态分布数据采用平方根反正弦变换后进行统 计分析，两两比较方差齐时采用 Turkey 检验法，方差不齐时采用 Dunnett ’s T3进行比较，P <0.05表示组间差异有统计学意义。基本营养成分分析数 据采用 t 检验。 2结果与分析 2.1 CO2水温对麻醉效果与无水保活的影响 通过对不同 CO2浓度海水（以水体 pH 值表示） 中珍珠龙石斑鱼的行为观察结果表明，当 pH 值达 到 6.5以下时鱼体呈现镇静状态（A2期），pH 值达 到 6.0以下进入麻醉状态（A3期），且不会达到窒 息死亡水平（A6期）；表 3显示，25 ℃水温中鱼体 进入麻醉 A4期的时间在 20min 以内，22、20和 15℃三个温度组的进入麻醉 A4期的时间均在 30min 以上。随着麻醉温度的降低，复苏时间延长，仅 25℃麻醉组复苏时间在 5min 内。根据 10min 之内麻 醉、5min 之内苏醒麻醉浓度标准要求 [10]，水温 25℃可作为珍珠龙胆石斑鱼捕捞、运输等操作的有效 麻醉温度。 石斑鱼在不同温度的 CO2麻醉溶液中麻醉后进 行无水保活，存活率随着时间的延长而降低。麻醉 温度为 15 ℃和 18 ℃时，10 h 存活率均可达到 100%。因此，15~18 ℃适合作为珍珠龙胆石斑鱼 的 CO2麻醉温度。综合考虑 CO2的麻醉效果与低温 应激作用，选择 18 ℃作为珍珠龙胆石斑鱼无水保 活的 CO2麻醉温度。 表 3不同麻醉温度下珍珠龙胆石斑鱼进入麻醉（A4期）与 复苏（R4期）的时间及无水保活不同时间的存活率 Table 3 Time of entering anesthesia stageA4 and time of recovery stageR4 under different anesthesia temperatures of grouper 麻醉温度 麻醉时间 复苏时间 存活率 Survival rate /% Anesthesia Anesthesia temperature /℃ time /min Recovery time /min 8 h1 9 h 10 h 11 h 12h 15 27.4±4.5c 13.1±2.4a 100 100 100 50 0 18 38.8±1.7ab 9.0±2.8b 100 100 100 50 25 20 44.3±6.1a 6.3±0.1c 100 75 50 25 0 22 34.1±6.5b 5.5±1.1c 100 75 25 25 0 25 18.8±1.1d 2.9±0.6d 100 50 50 0 注：同列标示不同字母表示差异显著（P < 0.05） Note ：different letters in the column indicate significant differences among the groups of at P < 0.05. 2.2 CO2浓度对无水保活时间和存活率的影响 随着 CO2浓度的增加，珍珠龙胆石斑鱼麻醉时 间减少。在 18 ℃，75mg/L 的 CO2溶液中进入麻 醉 A3期的时间最短（表 4），为 6~7min ，无水保 活 9h 后的存活率仍为 100%；125mg/L 与 75mg/L 组麻醉时间无显著差异（P >0.05），但 125mg/L 组 鱼体存活时间延长，10h 后存活率可达到 100%。因此，综合考虑麻醉时间、CO2影响及存活时间，选择 18 ℃、125mg/L 的 CO2溶液进行麻醉。 表 4不同 CO2质量浓度下珍珠龙胆石斑鱼的麻醉时间和无 水保活不同时间的存活率 Table 4 Anesthesia time and survival rate in different keeping-alive time of grouper under differentCO2mass fractions CO2质量浓度 麻醉时间 存活率 Survival rate /% CO2 concentration/ (mg/L) Anesthesia time/ s 8 h 9 h 10 h 11 h 12 h 13 h 30 952±118a 100 50 0 60 549±113b 100 50 0 75 376±74c 100 100 50 25 0 125 377±127bc 100 100 100 50 0 25 注：同列标示不同字母表示差异显著（P < 0.05） Note ：different letters in the column indicate significant differences among the groups of at P < 0.05 2.3麻醉时间对无水保活时间和存活率的影响 珍珠龙胆石斑鱼在 18 ℃、125mg/L 的 CO2溶 液中麻醉，随着麻醉时间的延长，珍珠龙胆石斑鱼 无水保活的存活率降低；麻醉 5min 后，无水保活 10h 鱼体存活率可达到 100%（表 5）。 表 5不同麻醉时间下珍珠龙胆石斑鱼的存活率 Table 5 Survival rate of grouper under different anesthesia time 麻醉时间 存活率 Survival rate /% Anesthesia time /min 7 h 8 h 9 h 10 h 11 h 5 100 100 100 100 50 10 100 75 50 0 15 100 25 0 20 50 0 25 25 0 2.4无水保活温度对保活时间和存活率的影响 珍珠龙胆石斑鱼经 25 ℃暂养 48h ，梯度降温 至 18 ℃后，再将鱼体转移至 18 ℃、125mg/LCO2溶液中麻醉 5min ，转移至无水保活箱中进行无水 保活。随着保活温度的上升和时间的延长，珍珠龙 胆石斑鱼的存活率下降；无水保活温度为 15 ℃时，11h 后鱼体存活率达到 83%（表 6）。 2.5 CO2麻醉无水保活过程中血清生化指标变化 石斑鱼在低温 CO2麻醉、无水保活及复苏过程 中鱼体代谢变化见表 7。CO2麻醉引起血清转氨酶 （ALT 、AST ）和 ACP 酶活性显著上升（P <0.05）；尿素氮水平（BUN ）增加 32.65%；血糖水平增加 59.47%。无水保活 10h 后珍珠龙胆石斑鱼血清中血 清转氨酶（ALT 、AST ）和碱性磷酸酶（AKP ）酶 活性均显著上升（P <0.05）；BUN 水平增加 2倍；血糖水平增加 2.36倍。复苏 12h 后鱼体血清 AKP 酶活性显著下降（P <0.05）；BUN 恢复到对照组水 平；血糖是对照组的 2.66倍。血清皮质醇水平在 CO2麻醉、无水保活与复苏过程中均无显著变化。 表 6不同保活温度下珍珠龙胆石斑鱼的存活率 Table 6 Survival rate of grouper at different keep-alive temperatures 保活温度 存活率 Survival rate /% Keep-alive temperature / ℃ 7 h 8 h 9 h 10 h 11 h 15 100 100 100 100 83 18 100 100 100 66.7 50 20 100 83.3 66.7 16.7 22 100 66.7 50 0 25 100 66.7 16.7 0 表 7 CO2麻醉无水保活过程对珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标影响 Table 7 Effect ofCO2 anesthesia and preservationwithoutwater on serum biochemical indexes of grouper 生化指标 对照组 麻醉组 无水保活组 复苏组 Biochemical indexes Control group Anesthesia group Preservationwithoutwater group Recovery group 谷丙转氨酶ALT活性/(U/L) 2.25±0.95c 86.65±3.90a 37.13±1.95b 1.12±0.08c 谷草转氨酶AST活性/(U/L) 2.25±0.86c 14.63±0.05b 27.01±5.16a 3.37±0.09c 酸性磷酸酶ACP活性/(U/100mL) 2.67±0.18b 3.88±0.00a 2.00±0.41c 2.86±0.30b 碱性磷酸酶AKP活性/(U/100mL) 8.22±0.21b 8.40±0.21b 12.31±0.31a 6.09±0.04c 尿素氮 BUN浓度/(mmol/L) 38.78±0.96c 51.44±0.84b 116.67±2.33a 41.56±0.84c 皮质醇 Cortisol质量浓度/(mg/L) 2.57±0.29a 2.69±0.45a 2.35±0.19a 2.84±0.29a 血糖Glu浓度/(mmol/L) 5.28±0.23d 8.42±0.16c 17.72±0.87a 14.06±0.51b 注：标示不同字母表示同一行不同组别间差异显著（P < 0.05） Note ：different letters in the line indicate significant differences among the groups at P < 0.05 2.6 CO2麻醉无水保活对珍珠龙胆石斑鱼游离氨 基酸的影响 暂养后的珍珠龙胆石斑鱼经 CO2麻醉后、低温 无水保活 10h 、有水复苏 12h 后肌肉中游离氨基酸 的含量变化见表 8。与对照组相比，CO2麻醉组与 无水保活组总游离氨基酸（TAA ）、必需氨基酸 （EAA ）、非必需氨基酸（NEAA ）含量均显著增加 （P <0.05），TAA 分别增加 87.2%和 77.0%，EAA 分别增加 43.4%和 25.7%，NEAA 分别增加 119.8%和 115.2%。复苏组 EAA 减少 27.8%，TAA 和 NEAA 无显著变化（P >0.05）。 与对照组相比，CO2麻醉组与无水保活组：5种氨基酸（Gly 、Lys 、Ser 、Thr 、Ala ）含量显著增 加（P <0.05）。复苏组 Gly 含量增加 145.8%；8种 氨基酸（Ser 、Tyr 、Asp 、Phe 、His 、Arg 、Glu 、Met ）含量下降 31%~60%。 珍珠龙胆石斑鱼经 CO2麻醉无水保活运输 10h 后，肌肉中鲜味氨基酸（Glu 、Asp ）与苦味氨基酸 （His 、Val 、Leu 、Ile 、Phe 、Tyr ）含量显著下降（P <0.05），而甜味氨基酸（Thr 、Gly 、Ser 、Ala ）含 量显著增加，比保活前增加 2.52倍。有水复苏 12h 后，鲜味与苦味氨基酸含量分别下降 36.79%和 31.53%，甜味氨基酸含量增加 43.52%。 2.7 CO2麻醉无水保活对珍珠龙胆石斑鱼营养成 分的影响 珍珠龙胆石斑鱼经 CO2麻醉无水保活运输 10h 后营养成分变化见表 9。肌肉水分含量有所下降，粗蛋白和粗脂肪含量分别下降 0.34%和 6.01%（以 干质量计），肌肉中糖原下降 5.67%。与低温休眠有 水保活运输模式相比，CO2麻醉无水保活运输能使 肌肉中糖原的降低量减少 4.81%，脂肪消耗量均约 为 6%；但与目前市场上常用的低温有水保活运输 模式相比，CO2麻醉无水保活运输能使肌肉中糖原、脂肪的降低量分别减少 60.60%和 32.77%（以干质 量计），表明 CO2麻醉可显著降低保活运输过程中 能量物质（肌肉糖原和脂肪）消耗，保证运输后鱼 肉品质。 表 8 CO2麻醉、无水保活与复苏后的珍珠龙胆石斑鱼肌肉游离氨基酸质量分数的变化（湿基） Table 8 Changes of free amino acids content inmuscle of grouper afterCO2 anesthesia,waterless keeping-alive and recovery in marine water （wet basis ） mg/100g 氨基酸 对照组 麻醉组 无水保活组 复苏组 Amino acid Control group Anesthesia group Preservationwithoutwater group Recovery group 甘氨酸(Gly) 14.23±1.36c 91.98±2.65a 92.33±5.24a 34.90±2.46b 赖氨酸(Lys) # 21.83±1.21c 51.61±3.58a 35.99±3.12b 15.80±2.04d 苏氨酸(Thr)# 5.41±0.09c 8.19±1.21b 9.81±0.07a 4.38±1.06d 丝氨酸(Ser) 4.41±0.23c 7.72±0.06b 9.89±0.34a 2.98±0.08d 丙氨酸(Ala) 15.08±1.02c 22.31±2.03b 25.78±0.98a 13.90±2.08d 酪氨酸(Tyr) 3.98±0.06a 2.32±0.18b 2.41±0.07b 2.08±0.07b 天冬氨酸(Asp) 4.63±0.05a 4.08±0.16ab 2.36±0.15b 2.45±0.28b 苯丙氨酸(Phe) # 3.97±0.52a 2.64±0.08b 2.92±0.06b 1.99±0.12c 组氨酸(His) # 4.98±0.21a 3.36±0.14b 4.26±0.08a 2.03±0.04c 精氨酸(Arg) 6.74±0.35b 8.34±1.24a 6.27±1.02b 3.10±0.08c 谷氨酸(Glu) 16.98±1.14b 18.53±1.06a 13.31±0.57c 11.21±1.28d 蛋氨酸(Met) # 3.98±0.34a 3.06±0.58b 3.42±0.68ab 2.73±0.08c 缬氨酸(Val) # 5.32±0.17a 4.02±0.62b 4.56±0.34ab 4.28±0.32b 亮氨酸(Leu) # 6.45±0.11a 5.12±0.85c 6.24±0.85ab 5.80±0.65b 异亮氨酸(Ile) # 4.89±0.26a 3.57±0.06c 4.27±0.24b 4.08±0.27b 脯氨酸(Pro) 10.33±0.16c 12.47±0.21a 11.82±1.26a 8.52 ±1.34b 必需氨基酸 EAA 56.83±1.91c 81.57±3.26b 71.47±4.52a 41.09±3.28d 非必需氨基酸NEAA 76.38±3.45b 167.75±6.42a 164.2±2.65a 79.14±2.52b 游离氨基酸总量 TFAA 133.21±5.38c 249.32±8.78a 235.67±6.85b 120.23±4.38c 鲜味氨基酸DAA 21.61±0.59a 22.61±1.26a 15.67±2.31b 13.66±1.25c 甜味氨基酸 SAA 39.13±2.38c 130.2±4.88a 137.81±5.64a 56.16±5.62b 苦味氨基酸 BAA 29.59±1.84a 21.03±2.34c 24.69±2.46b 20.26±3.28c 注：#为必需氨基酸；上标不同字母表示同行比较差异显著（P < 0.05） 表 9不同保活模式对珍珠龙胆石斑鱼基本营养成分质量分数的影响 Table 9 Effects of different keeping-alive patterns onmass fraction of basic nutrients of grouper 保活运输 阶段 水分 粗蛋白 粗脂肪 肌糖原 Live transportation Stage section Water /% Crude protein /% Crude fat /% Muscle glycogen / (mg/g) CO2麻醉无水保活 保活前 77.78±0.49 19.34±0.76 1.83±0.01 1.94±0.07 运输模式 保活后 76.69±0.18 20.22±1.15 1.72±0.49 1.83±0.04 低温休眠有水保活 保活前 75.29±0.28 19.96±0.49 2.34±0.16 1.95±0.09 运输模式 保活后 74.68±0.27 19.86±0.13 2.21±0.04 1.76±0.03* 低温有水保活运输 运输前 76.45±0.73 19.13±0.08 1.73±0.18 1.86±0.16 （实际生产） 运输后 77.13±0.06 18.62±0.02 1.42±0.29 1.40±0.02* 注：*与保活前或运输前相比差异显著（P < 0.05） Note: * indicate significantly difference between the before and after of keeping-alive or live transportation （P < 0.05） 3讨论 3.1 CO2对珍珠龙胆石斑鱼的麻醉效果 CO2是一种有效的渔用麻醉剂，在淡水鱼中具 有较多的应用，如在鲢鱼的研究中采用了 25 ℃时 155mg/L 的 CO2能起到较好的麻醉效果，且产生的 应激程度较一次性充 O2方式更低 [13]。在海水鱼类 中，如白线鳕（Anyperodon leucogrammicus )、三线 矶鲈（Parapristipoma trilineatum ）、日本竹 䇲 鱼 （Trachurus japonicas ）和真鲷（Pagrus major ）等 中，CO2可在 10min 内诱导鱼体进入麻醉状态，在 2min 内恢复平衡，麻醉 24h 后死亡率 <5%[10-11,14]。在本实验中，珍珠龙胆石斑鱼在 18 ℃、质量浓度 125mg/L 的 CO2溶液中，能完全进入麻醉状态（A4期），且在 5min 内完全恢复，表现出较好的麻醉效 果，说明 CO2可作为麻醉剂用于鱼类的捕捞、操作 与保活运输中。管维良等 [13]研究发现，罗非鱼在高 氧浓度的 CO2水溶液中的保活时间延长 60%。 与常用的化学麻醉剂相比，CO2麻醉是一种绿 色安全的麻醉剂。然而当 CO2浓度过高或在组织中 局部累积时，就会造成鱼窒息致死 [15]。且水体中溶 解 CO2会使水体变酸，麻醉时间过长会导致鱼体组 织损伤。因此，为了降低 CO2的使用浓度，常将 CO2与其它方式结合使用，如 CO2结合低温麻醉 [13]、CO2+MS-222麻醉等。本实验中采用 CO2与低温结 合，在 18 ℃、125mg/LCO2溶液中麻醉后进行无 水保活，与低温休眠无水保活相比，无水保活的时 间延长了 25%[13,16]。 水温是影响麻醉剂麻醉效果与保活运输的关 键因素之一。水温升高，鱼体内新陈代谢活动增加、呼吸频率增加，麻醉剂渗透过腮丝的速率加快。因 此，高温下鱼体达到各麻醉阶段的时间较短。本研 究发现，在 20~25 ℃水温范围，随着温度上升， CO2麻醉时间减少，复苏时间也相应缩短；而在低 于 20 ℃水温时，随着温度的降低，麻醉时间减少，复苏时间延长，这是因为低温同样具有镇静作用。在 15~20 ℃水温范围，由于低温与 CO2的共同作 用，导致麻醉时间减少，这与罗非鱼 [6]的 CO2麻醉 效果相同；同样由于低温作用使鱼体代谢能力下 降，在复苏过程需要时间恢复，导致复苏时间会延 长。而在高温下，由于鱼体呼吸频率增加，CO2可 通过鳃的呼吸作用排出体外，可降低血液中 CO2的 浓度，从而使复苏时间减少。 3.2 CO2麻醉对无水保活珍珠龙胆石斑鱼应激响 应的影响 麻醉剂作为一种应激源，也会引起鱼体的应激 响应，皮质醇、血糖、乳酸等应激指标发生变 化 [17]。与其他化学麻醉剂相比，CO2引起鱼体的应 激反应低 [18]，且应激后能迅速降至麻醉前水平 [9]。研究表明，黄尾 （Seriola lalandi Valenciennes ）幼鱼在 75mg/LCO2水体中血糖、乳酸等应激指标 无显著变化 [9]。本研究发现，CO2麻醉、无水保活 10h 及复苏后血清皮质醇水平均无显著变化，这与 鲢 [14]的研究结果一致；但血糖显著上升。表明鱼类 在应对急性应激的激素和代谢反应方面存在着重 要的物种特异性差异 [19-20]，珍珠龙胆石斑鱼应对 CO2麻醉主要表现在代谢应激响应。 ALT 和 AST 是蛋白质代谢的两种重要转氨酶，是反映细胞膜完整性的重要指标；ACP 和 AKP 水 平是反映肝细胞损伤的定量指标。鲈（Lateolabrax maculatus ）在 MS-222和丁香酚麻醉后 ALT 、AST 和 AKP 均显著升高 [20]，与本研究一致。本研究中，珍珠龙胆石斑鱼在有水复苏后，ALT 和 AST 、ACP 恢复正常水平，表明 CO2麻醉引起的代谢变化是可 恢复的。 CO2麻醉与低温休眠无水保活胁迫下珍珠龙胆 石斑鱼的 BUN 均显著上升，表明其肾脏功能障碍 或部分受损，这与罗非鱼、鲢的研究结果一 致 [6, 14]；有水复苏后 BUN 能恢复到正常水平，这表 明鱼体在新鲜海水中，吸收频率能恢复正常，且鱼 体血中 CO2水平下降，有氧代谢恢复。 氨基酸在石斑鱼应对低温胁迫的能量代谢响 应中起着重要作用 [21-24]。在本研究中，石斑鱼在低 温 CO2麻醉与低温休眠无水保活胁迫下 TFAA 、EAA 均显著上升，这与低温休眠应激响应一致 [16]。鱼体经 CO2麻醉与无水保活胁迫 10h 后，能量消耗 减少。其中甘氨酸（Gly ）是内源性抗氧化剂还原 性谷胱甘肽的组成氨基酸，CO2麻醉、无水保活与 有水复苏组珍珠龙胆石斑鱼 Gly 含量分别增加 5.5、5.5和 1.5倍，表明 Gly 在体内抗氧化应激中发挥重 要作用。Ser 和 Thr 可提高鱼体低温下的抗冻性 [23]。 Lys 、Ala 和 Ser 水平的增加表明鱼体在缺氧条件下 糖异生作用增强 [21]，合成的葡萄糖，使血糖水平上 升。Arg 参与动物肝脏和肌肉葡萄糖摄取和氧化以 及脂肪酸氧化，Lys 和 Met 是合成 L-肉碱的底物，在鱼类中将长链脂肪酸运输到氧化点所必需的 [22]，有水复苏后珍珠龙胆石斑鱼恢复有氧代谢，能量动 员增加，肌肉中 Arg 、Met 和 Lys 水平的下降，可 能与葡萄糖和脂肪酸的氧化供能有关。 3.3 CO2麻醉对无水保活珍珠龙胆石斑鱼营养品 质的影响 CO2麻醉无水保活珍珠龙胆石斑鱼 10h 后肌肉 中营养物质的变化主要是脂肪与糖原下降，表明此 过程中脂肪与糖原是主要的能量物质，与其他鱼体 的应激响应一致 [25-26]。但与低温休眠保活相比，CO2麻醉能降低能量物质的消耗，保证保活后的鱼肉品 质，这也是 CO2麻醉能延长珍珠龙胆石斑鱼无水保 活时间的原因之一。在虾夷扇贝无水运输过程中，呈味化合物中 Gly 、Arg 、Ala 与 Glu 作为影响扇贝 风味的重要化合物使得要扇贝流通过程中鲜味和 甜味下降 [27]，在石斑鱼的保活运输后，鲜味与苦味 氨基酸含量显著下降，而甜味氨基酸的含量显著增 加，这表明石斑鱼保活流通过程中风味的变化是多 种风味化合物共同作用的结果，有待进一步探讨。 4结论 本研究采用绿色安全的 CO2对珍珠龙胆石斑鱼 进行麻醉预处理，结果表明 CO2用于麻醉珍珠龙胆 石斑鱼是有效可行的，CO2协同低温麻醉预处理后 的珍珠龙胆石斑鱼在低温下无水保活 11h 的存活 率可达到 83.3%，有水复苏后甜味氨基酸含量增加，保活效果优于低温休眠无水保活模式。CO2对无水 保活珍珠龙胆石斑鱼的应激响应主要表现在能量 代谢响应方面，且在有水复苏后鱼体代谢酶活性能 恢复正常水平。 参考文献 [1] RIMMER MA, GLAMUZINA B. 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