虾夷扇贝（夏威夷贝）中蛋白质和脂肪含量的检测

冷胁迫诱导休眠方式对虾夷扇贝无水保活期生命特征及营养品质指标的影响南 方 水 产 科 学South China Fisheries Science第 19卷第 3期2023年 6月Vol.19, No.3Jun., 2023 南方水产科学第19卷130 DOI : 10.12131/20220304 文章编号:2095-0780-(2023)03-0129-11 冷胁迫诱导休眠方式对虾夷扇贝无水保活期生命特征及营养 品质指标的影响 常向阳1,22,姜沛宏1,2,,邓 杰12,,范秀萍1.2,秦小明1,2 1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江524088 2.国家贝类加工技术研发分中心 ((湛江 )/广东省水产品加工与安全重点实验室 /水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江524088 摘要：探究虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis 保活运输前的最佳诱导休眠方式，可为其保活流通提供理论依据。参考产 业实际流通，采用散冰降温和急性降温和梯度降温 3种低温诱导休眠方式处理虾夷扇贝，探讨了不同降温休眠方式对虾 夷扇贝无水保活期的成活率、生命特征及营养品质的影响。结果表明：梯度降温组在 44℃条件下保活 33d 后的成活率为 93.33%，明显高于急性降温和散冰降温组；在降温休眠过程中，散冰降温和急性降温组由于温度骤变，无法检测到规 律的心电图，梯度降温组的心率呈规律性缓慢下降趋势；保活期间，各组扇贝的心率均呈下降趋势，保活 33d 后，散冰 降温组已无规律心率，梯度降温和急性降温组仍有规律心率；3组降温方式的缩边率和外套膜响应时间均呈逐渐上升的 趋势，其中散冰降温和急性降温组的缩边率和外套膜响应时间显著高于梯度降温组，且心率与外套膜响应时间呈负相 关关系；水分、粗蛋白、粗脂肪和肌糖原含量均呈下降趋势，其中对肌糖原的消耗最大，梯度降温组相较于其他组在 保活期营养成分损失较少，且梯度降温组的闭壳肌在微观组织结构上排列紧密整齐，无明显断裂。研究表明，采用梯 度降温诱导扇贝进入休眠或半休眠状态后开始无水保活，有利于提高活体扇贝的成活率，减少其在流通过程中营养成 分的损失，进而保持其活力，更有利于其无水保活。 关键词：虾夷扇贝；冷胁迫；保活流通；生命特征；营养品质 中图分类号:S983 文献标志码： A 开放科学（资源服务）标识码（SID)）： Effects of cold stress-induced dormancy methods on life characteristics and nutritional quality indexes of Patinopecten yessoensis during anhydrous living-preservation CHANG Xiangyang,JIANG Peihong,DENG J ie , FAN Xiuping QIN Xiaoming2 1. College of Food Science and Technology , Guangdong Ocean University , Zhanjiang 5524025 China 2. National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang )/Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety/Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution , Zhanjiang 524088, China Abstract : Exploring the best method to induce the dormancy of scallops (Patinopecten yessoensis) before l ive transport can provide a t heoretical basis for their survival and circulation. Referring to the actual industrial circulation, we treated t he samples by t hree methods of natural cooling of crush ice, acute continuous cooling and gradient cooling, so as to explore the effects of 收稿日期:2022-11-28;修回日期:2023-01-23 different cooling and dormancy methods on the survival rate, l ife characteristics and nutritional quality of scallops during an-hydrous l iving-preservation. The results show that the survival rate of the gradient cooling group was 93.33% after 3 d of keep-ing alive at 4 ℃, significantly higher t han that of the acute and natural cooling groups. I n t he process of cooling dormancy, regu-lar electrocardiogram could not be detected in the natural and acute cooling groups due to the sudden temperature change, and t he heart rate in the gradient cooling group showed a regula r slow decline. During t he l ive t ransport, the heart rate i n each group showed a decreasing trend. After 3 d of keeping alive, t he i rregular heart rate in t he natural i ce cool i ng group was no longer ob-served, while the irregular heart rate in the gradient and acute cooling groups was still observed. The edge mantle retraction ra-tio and the response t ime of all three cooling groups tended to increase gradually (Those of natural and acute cooling groups were significantly higher than those of gradient cooling groups), and t he heart rate was negatively correlated with the response time of the mantle. The contents of water, crude protein , crude fat and musc l e glycogen all showed a decreasing t rend, and the consumption of glycogen was the largest. Less loss of nutrients before l ive transport was observed in the gradient cooling groups compared with the other groups. The microstructure also shows that the closed shell muscles in the gradient cooling group were closely arranged without an obvious frac t ure. This study indicates that inducing P. yessoensis to enter dormancy or semi-dormanc y s tate by gradient cooling and t hen keeping them alive without water, is beneficial to i mproving the survival rate of liv -i ng P. yessoensis, reducing the loss of nutrients during the l ive transport, and maintaining the vitality of living P. yessoensis, so i t is more conduc i ve to i ts anhydrous living-preservation. Keywords: Patinopecten yessoensis; Cold stress; Live transport; L i fe character i stics ; Nutritional quality 2021年中国扇贝养殖产量达 183.0×10*t,其中 虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis 是中国北方重要 的海水养殖贝类之一 口 口 口 ，具有个体大、贝柱肥美、营养价值高等特点。活品虾夷扇贝作为一种高端海 产品深受消费者喜爱，但虾夷扇贝为北方特有，在 销往南方市场时多以冻品、罐头为主，仅部分以活 品形式运往南方。活品虾夷扇贝的流通运输方式主 要有无水保活运输和有水保活运输两种，其中无水 保活运输因具有运输成本低、运输密度高、包装简 易方便等特点被广泛应用 。。。目前，国内外活品虾 夷扇贝的无水运输已有较多研究报道，但对无水保 活前的降温休眠工艺技术鲜有研究，缺乏系统的降 温预冷技术。在实际产业中，虾夷扇贝经采捕后直 接装入泡沫箱或在箱中加入碎冰和冰袋强迫其进入 休眠状态，后进行保活运输。然而，温度骤降会对 虾夷扇贝机体的正常生理代谢及成活率产生直接影 响，因此保活前合理的降温诱导休眠方式对保持活 体虾夷扇贝的品质至关重要。 由运输时间延长导致的品质下降是活品虾夷扇 贝流通链存在的主要问题。相关研究多通过抗氧化 能力、代谢组学、能量代谢 [3-5]等阐述活品虾夷扇 贝在保活期间的品质变化规律，而在实际保活运输 中经验丰富的工人通过扇贝的气味、缩边率、开壳 率等判断其活力和品质，前者实验周期长、步骤繁 琐、对仪器要求严格，后者具有较强的主观性，在 科学性和准确性方面仍有欠缺 。。。。因此，为扇贝保 活流通提供一种快速简便、可直观准确判断扇贝活 力的指标，将有助于促进活品贝类运输业发展。心 脏活动传递着生物体是否存活以及作为外界环境变 化的响应信息，在海洋无脊椎动物中已有用于评价 其生理状态的相关报道。海洋无脊椎动物中心率作 为心脏活动中的重要参数,早在1990年De-pledge等 7通过捕获红外信号的方法准确测得,该 方法因高效稳定且对个体无损伤而广泛应用于测定 贝类心脏对温度(8]、溶解氧 、水质[10]等各环境因 子的反应。Xing 等 11]研究发现栉孔扇贝 (Chlamys farreri 的心率随海水温度的升高逐渐上升，当达 到一定温度时心率出现拐点呈下降趋势直至心率消 失，且心率与栉孔扇贝成活率有较高的相关性，进 一步说明扇贝的心率与个体生理状况息息相关，可 作为扇贝的一个生命特征指标。 本研究通过模拟当前虾夷扇贝的流通模式，将 采捕后的虾夷扇贝立即运送至实验室暂养净化 224h ，净化后采用不同的降温方式对其进行诱导休 眠处理，探讨了不同诱导休眠方式对虾夷扇贝成活 率、生命特征及营养品质指标的影响，以期为活品 虾夷扇贝的保活流通前处理工序提供技术和理论 参考。 材料与方法 1.1 材料与试剂 实验所用鲜活虾夷扇贝，2022年 4月购自山 东威海寻山集团,规格为壳长(79.39±2.31) mm、壳宽 (81.86±2.27)mm、壳厚(19.58±1.27)mm、总 体质量 (57.75±2.86) g 。虾夷扇贝采捕后挑选有活 力、无破损的个体作为实验对象，于 11h 内从码头 运输至寻山集团实验室，立即用海水清洗表面污垢 并清除表面附着物，然后在暂养箱内进行流水暂养 净化。 1.2 仪器与设备 心率测定装置: CNY-70红外感受器、AMP-03心跳信号放大器、PowerLab 八通道研究型高速 记录主机以及电脑软件分析终端 (LabChart v8)(德 国 AD Instruments 公司); GXZ-280B 智能精准多功 能培养箱(宁波江南仪器厂); CL-650 日生冷水机 (广东日生集团有限公司); PR224ZH 精密天平(美 国 OHAUS 公司);5810R冷冻离心机(德国Eppen-dorf公司); JK-8多点温度计(常州金艾联公司); Varioskan Flash 全自动酶标仪(美国 Thermo 公 司);VAP450 全自动凯氏定氮仪(德国 Gerhardt 公 司) 1.3 实验设计与方法 1.3.1 虾夷扇贝净化方法 参照贝类净化技术规范 SC/T 3013—2002,使 用海水晶与去离子水在暂养箱内配制成盐度为 (32.0±0.5)%o的人工海水,同时充氧曝气24h以 上,以流速2.5 mh 循环制冷至15℃,将清洗后 的虾夷扇贝分装于塑料筐，置于预冷的循环人工海 水中净化暂养 224h ，在暂养期间不投喂饵料，保持 水体溶解氧质量浓度≥8mg·L,及时捞出死贝,净化完成后挑选有活力的个体进行下一步实验。 1.3.2 虾夷扇贝生态冰温的确定 虾夷扇贝生态冰温的测定按照林恒宗等 [[12的 方法，由临界温度和冻结点测定结果确定虾夷扇贝 生态冰温范围。 1.3.3 虾夷扇贝休眠诱导方法 挑选净化后富有活力的虾夷扇贝 00只 只，随机 分为 3组，每组 100只，分别采用散冰降温、急性 降温和梯度降温 3种降温诱导休眠方式。散冰降温 处理方式为将扇贝分装于铝箔保温袋中，在扇贝上 方和周围加入淡水冰，将装有扇贝的保温袋装入泡 沫箱中，并在箱底平铺约 cm 厚的冰袋，加盖后 放置在 44℃恒温培养箱内进行无水保活；急性降 温处理方式为将净化后的扇贝直接放入提前预冷 至 44℃的海水中，停留 11h ；梯度降温处理方式为 通过调节降温装置，以 33℃·h 的降温速率从 (15.0±0.5)℃降温至(4.0±0.5)℃,每下降3℃停 留 11h ，扇贝在诱导休眠结束后分装至铝箔保温袋 中，再移装至铺有冰袋的泡沫箱中，加盖后放置 在 44℃恒温培养箱内进行无水保活。 1.3.4 心率测定方法 [13]心率测定方法按照 Bakhmet 等 的方法稍作 修改 ((图 )1)，连接好装置，调节温控装置至 515℃，并在水体中充氧。对扇贝外壳进行清理，将红外感 端粘附在扇贝壳外靠近心脏位置,在 PowerLab 仪 信号放大器 AM03 图 虾夷扇贝心率测定流程图 器所附带的 abChat 软件中设置相关参数量程 (2~5V)、低通(1~10 Hz)、交流耦合,检测之前 5 min,，将扇贝放到恒温恒氧的的海水环境中，待 外套膜触须充分施展开后进行测定。 1.3.5 样品采集与制备 本实验分别在降温前(BC)、降温后(AC)、保 活1d(KAld)、保活2d(KA2d)和保活 3 d(KA3d)取样，每组随机取活体虾夷扇贝 10只，迅速开壳 取闭壳肌和腮组织，用预冷质量分数为 0.86%的生 理盐水漂洗，吸水纸拭干表面水分，冰浴高速混合 匀浆成肉糜状，立即使用或液氮速冻后置于 --8-80℃冰箱。 1.4 各指标的测定 1)成活率：用玻璃棒轻轻敲打，针轻刺扇贝，观察是否有闭壳行为，长时间不闭壳则判定扇贝死 亡;成活率=成活个数/总个数x100%。 2)微观组织结构观察按照 Chen[14]的方法稍 作修改,将虾夷扇贝横纹肌样品 (5mmx5 mmx 3 mm) 使用固定液(体积分数为10%的甲醛溶液)固定 224h 以上，固定后的样品使用流水清洗 24h,分别使用体积分数为70%、85%、95%和无 水乙醇进行梯度脱水，使用二甲苯进行 30 min 、2次透明处理，,60℃条件下石蜡透蜡，包埋，修 整，切片 ((纵切 ))，用苏木精 -伊红染色，制成标 本，利用光学显微镜进行组织学观察。 3)缩边率和外套膜响应时间参照李亚恒等 [15]的研究，缩边率 =缩边距离 /壳高 ×100%，外套膜刺 激响应时间使用尖头镊子刺激活体虾夷扇贝外套 膜，用秒表记录外套膜收缩时间 (s)；心脏活动：利用 LabChart 软件记录扇贝心跳波形稳定时的变 化情况，截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明显区分扇贝 2个心耳的波形和 1个心 室的波形，得到完整光滑的波形图，计算出 10 min 检测时间内稳定波形的心跳频率和心跳波幅，每次 测定 5只虾夷扇贝，平行测定 3次。 4)营养成分测定：严格按照试剂盒操作规程 检测肌肉组织中糖原、乳酸，水分、粗蛋白、粗脂 肪质量分数分别按照国标 GB 5009.3—2016、GB 5009.5--2016、GB 5009.6-—20166测定。 1.5 数据分析 实验结果平均测定 3次，结果以 “平均值 ±标 准差(X±SD)”表示。采用 SPSS 26.0 软件处理实验 数据,通过单因素分析法进行方差分析,用 Duncan's 法进行组间多重比较，显著性水平设为 P <0.05，使用 Origin 2021 软件进行绘图。 2 结果 2.1 虾夷扇贝生态冰温零点 不同温度下通过机体呼吸及行动状态可以确定 动物的休眠温度，在缓慢降温过程中虾夷扇贝的行 为特征如 表 1所示。在 33℃以上，虾夷扇贝活动正常；当温度降至 33℃时，大部分虾夷扇贝双壳紧闭，无跳跃逃逸滤水行为，对于部分壳微开的扇贝，使 用玻棒敲击可缓慢闭合；;1℃时，全部双壳紧闭，玻棒敲击无反应；;0℃时，双壳紧闭，用玻棒敲击 刺激无反应，但置于常温海水中短时间内能恢复正 常生理活动；当温度降至 00℃以下时，外壳边缘 开始出现结冰现象，用玻棒敲击刺激无反应，且随 温度降低成活率持续下降。 表 1 不同温度下虾夷扇贝活动状态 Table 1 Status of P. yessoensis at different temperatures 温度 成活率 目测现象 Temperature/℃ Survival rate/% Visual inspection phenomenon 10 100 双壳自然张开，外套膜眼点清晰，腮丝分明，触须自然伸出，轻触迅速闭壳，闭壳力度大，有 跳跃逃逸滤水行为 5 100 部分双壳微张，部分闭合，部分可看到外套膜眼点，不见腮丝、触须，轻触部分无反应，部分 缓慢闭壳，闭壳力度小，无跳跃逃逸行为，部分有滤水行为 3 100 大部分双壳紧闭，少部分壳微开，玻棒敲击缓慢闭壳，离水后10 min内可正常开壳闭壳 1 100 双壳紧闭，玻棒敲击无反应，置于115℃海水约15 min可缓慢开壳闭壳 0 100 双壳紧闭，玻棒敲击无反应，置于115℃海水中约22h恢复正常开壳闭壳 一1 100 双壳紧闭，玻棒敲击无反应，扇贝边缘及外壳有微冻现象，置于115℃暂养约33h部分扇贝壳微开 -2 80 双壳紧闭，玻棒敲击无反应，扇贝边缘及外壳出现冰膜，将部分扇贝开壳，发现外套膜有微冻 现象，其余扇贝置于515℃海水中暂养33h部分壳微张，轻触缓慢闭壳，有部分扇贝死亡 2.2 虾夷扇贝生态冰温值的测定 结合生态冰温零点与结冰点可以确定虾夷扇贝 的生态冰温值。通过测定虾夷扇贝的结冰点，确定 其所能承受的极限温度，才能控制合适的低温使虾 夷扇贝处于休眠或半休眠的状态而不至于温度过低 导致其死亡。虾夷扇贝的体温随时间的变化如 图 2所示，当温度降至 ---2.2℃时，其闭壳肌降温 速度变缓慢，因此确定扇贝结冰点为 ---2.2℃。结 合虾夷扇贝生态冰温零点，虾夷扇贝在无水保活运 输过程中温度范围应控制在 -2.2~0℃之间。越接 近冰点温度对机体过冷损伤越大，因此在无水保活 运输过程中应尽量远离结冰点温度。结合产业实际 保活流通运输过程中控温系统难以降温至 44℃以 下，因此选择 44℃为虾夷扇贝的半休眠温度。 虾夷扇贝冻结曲线 即 Fig.2F Freezing curve of P. yessoensis 2.3 冷胁迫休眠诱导方式对虾夷扇贝无水保活期 间成活率的影响 在不同的冷胁迫下虾夷扇贝的成活率随时间的 延长均呈下降趋势 ((图 3)。散冰降温、急性降温和 梯度降温组在保活3d后的成活率分别为 53.33%、83.33% 和93.33%,其中散冰降温组在保活第1天 出现死贝，急性降温组在保活第 2天出现死贝，说 明降温休眠方式对虾夷扇贝保活期成活率有较大 影响。 2.4 冷胁迫休眠诱导方式对虾夷扇贝无水保活期 间生命特征指标的影响 2.4.1 降温过程中虾夷扇贝心电图变化 在降温过程中，散冰降温和急性降温组在降温 后无法检测到规律的心电图，这可能由温度骤降所 致，而梯度降温组有规律的心电图。为了揭示在梯 图3 不同冷胁迫方式下虾夷扇贝无水保活期间的成活率 Fig.3 Survival rate of P. yessoensis during anhydrous living-preservation by different cold stress methods 度降温过程中虾夷扇贝心率、心跳幅度与温度的相 关性，对其进行了线性拟合分析。如 图 4-a 所示，虾夷扇贝心率随温度的降低呈逐渐下降的趋势，水 温为15℃时,虾夷扇贝心率为 18.39次·min-l,随着温度的降低心率以 1.21 次·min-1.℃-的速率 下降,当水温为4℃时,虾夷扇贝心率为 7.39次·min。对心率与温度进行线性拟合后得到回归方程，其中 回归方程决定系数 R²=0.973 78,说明在梯度降温 过程中扇贝心率与温度有良好的正相关关系。如 图 4-b 所示，虾夷扇贝的心脏振幅随温度的下降呈 波动上升趋势，在梯度降温阶段心脏振幅从 1.59升至 .1.63V ，与温度呈负相关关系，回归方程决定 系数R’=0.5212。 2.4.2 无水保活期间心电图的变化 由 表 2可知，无水保活期间虾夷扇贝的心率均 显著高于降温前且整体呈逐渐下降趋势。保活前虾 夷扇贝平均心率为 18.39 次·min-,保活期间心率 均大于 20 次·min-'。保活1~2d,散冰降温组的心 率显著低于其他降温组(P<0.05),急性降温和梯 度降温组间无显著性差异；保活 33d 后，散冰降温 组已无法检测到规律的心率，急性降温和梯度降温 组仍有规律的心率。 由 表 3可知，无水保活期间虾夷扇贝心脏振幅 与降温前相比无较大波动且整体呈下降趋势。保 活 ~1~2d ，梯度降温组的心率显著低于其他降温组 (P 0<0.05)，散冰降温和急性降温组间心脏振幅无显 著性差异；保活 33d 后，散冰降温组已无规律的心 脏活动，急性降温组的心脏振幅显著高于梯度降温 组(P<0.05)。 2 图4 梯度降温过程中水温与心率、心脏振幅的相关性分析 ((阴影区域为 95%置信区间 ) Fig.44C Correlation analysis of water temperature with heart rate and cardiac amplitude during gradient cooling process (95% confidence i nterval in shaded area) 表 2 冷胁迫休眠诱导方式对虾夷扇贝保活期间心率的影响 Table 2 Effect of cold stress on heart rate of P. yessoensis during keep alive period 次 ·min−1 冷胁迫方式 降温前 Before cooling 保活1d Keep alive for l d 保活2d Keep alive for 2 d 保活3d Keep alive for 3 d Cold stress 散冰降温 Natural cooling of crush ice 22.26±0.17° 21.55±0.23° 急性降温 Acute cooling 18.39±0.3 27.18±0.37 24.6±0.91 21.23±0.17° 梯度降温 Gradient cooling 26.17±2.47 25.89±1.94 22.10±1.09° 注：同列不同上标字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)；表 3同此。 注：同列不同上标字母表示组间有显著性差异 (P <0.05)；表 3同此。 Note: Di f ferent superscript letters indicate significant differences among t he groups (P<0.05). The same case in Table 3. 表 3 冷胁迫休眠诱导方式对虾夷扇贝保活期间心脏振幅的影响 Table 3 Effect of cold stress on cardiac amplitude of P. yessoensis during keep alive period V 冷胁迫方式Cold stress 降温前 Before cooling 保活1d Keep alive for 1 d 保活2d Keep alive for 2 d 保活3d Keep alive for 3 d 散冰降温 Natural cooling of crush ice 1.63±0.00° 1.59±0.02 急性降温 Acute cooling 1.59±0.1 1.61±0.02° 1.58±0.00° 1.60±0.01 梯度降温 Gradient cooling 1.58±0.00° 1.52±0.00° 1.53±0.01° 注：“一”代表无规律的心电图。 注：“一 ”代表无规律的心电图。 Note:"-"represents i rregular elec t rocardiogram. 2.4.3 缩边率和外套膜响应时间的变化 缩边率与外套膜刺激响应时间是目前虾夷扇贝 产业流通实际中常用且直观的表观活力指标，通过 缩边率(图5-a)与外套膜刺激响应时间(图5-b)分 析冷胁迫方式对保活过程中虾夷扇贝活力的影响。可知，3组降温方式的缩边率和外套膜响应时间均 随保活时间的延长呈上升趋势，其中散冰降温组的 缩边率和外套膜响应时间显著高于其他两个降温 组，这可能是由于散冰对活体虾夷扇贝造成了较大 胁迫，同时在保活过程中散冰发生融化使虾夷扇贝 长时间浸泡在水中，细菌滋生容易导致虾夷扇贝整 体品质活力下降。 图 6为梯度降温和急性降温组生命特征指标的 相关性分析。结果显示：梯度降温组的心率、心脏 振幅与外套膜响应时间呈负相关关系，相关系数分 别为-0.6267、-0.5448;急性降温组的心率与外套 膜响应时间呈负相关关系,相关系数为-0.8720。梯度降温和急性降温组的心率与与外套膜响应时间 有显著相关性 (P<0.05),说明活体虾夷扇贝心率 越低，外套膜刺激时间越长，虾夷扇贝活力越差。 图5 虾夷扇贝保活期缩边率和外套膜响应时间的变化 注：同一时间下，不同小写字母表示组间有显著性差异 (P <0.05)。 Fig.5 Mantle retraction ratio and mantle response time of P. yessoensis Note: At the same time, di f ferent lowercase letters indicate significant differences among the groups (P<0.05). *. P ≤0.05 图6 梯度 ((a)和急性 ((b)降温组生命特征指标相关性热图 注：由于散冰降温组在保活第 3天无规律心电图，在此不做相关性分析。 Fig.6 Heat map of correlation of vital feature i ndicators i n gradient (a) and acute (b) cooling groups Note: Since the natural cooling group had an i rregular electrocardiogram on t he 3day of keeping alive, no corre l ation analysis is conducted. 2.5 冷胁迫休眠诱导方式对虾夷扇贝无水保活期 间营养品质指标的影响 2.5.1 微观组织结构 如 图 7所示，降温休眠前虾夷扇贝闭壳肌纤维 排列紧密整齐、分布均匀，无明显间隙；梯度降温 后虾夷扇贝微观组织无明显变化，急性降温和散冰 降温休眠后其闭壳肌纤维出现了不同程度的损伤，均出现了闭壳肌纤维断裂、间隙增大的现象，其中 散冰降温组微观组织结构损伤较明显；保活 33d 后 3组降温方式的微观组织均出现了一定的损 伤破坏，其中梯度降温组仅出现轻微的闭壳肌纤维 断裂，急性降温组的闭壳肌纤维发生弯曲且断裂明 显，产生细小间隙，散冰降温组的闭壳肌纤维不仅 断裂明显，且产生宽大间隙，微观组织结构破坏严 重。温度骤降和长时间的低温环境对机体组织结构 造成一定程度的损伤，这在凡纳滨对虾 (Litope -naeus vannamei 肝胰腺组织结构 1116和武昌鱼 ((Me-galobrama amblycephala 肌肉组织中 1[17也有体现。 2.5.2 主要营养物质的变化 冷胁迫方式对虾夷扇贝的主要营养物质均有影 响，其中水分、粗蛋白、粗脂肪和肌糖原质量分数 有不同程度的下降，肌乳酸质量摩尔浓度呈上升趋 势 ((表 4)。散冰降温组在降温后肌糖原和肌乳酸有 显著性变化，急性降温和梯度降温组在降温后营养 成分无显著性变化。保活 33d 后，散冰降温组粗蛋 白、粗脂肪、肌糖原质量分数显著低于其他降温 组，水分和肌乳酸质量分数显著高于其他降温组；急性降温组粗脂肪、肌糖原、肌乳酸质量分数与梯 图7不同冷胁迫方式对虾夷扇贝冰温保活期肌肉组织结构的影响 ((纵切面 x400) 注:a.保活前;b.梯度降温组; c.急性降温组;d.散冰降温组; BC.降温前; AC.降温后;黑色箭头指示肌间间隙变化情况，红色箭头指示肌纤维断裂变化情况。 Fig. 7Effect of different cold stress methods on P. yessoensis during keep alive period at ice t emperature (Longitudinal sectionsx400) Note: a. Before keeping alive; b. Gradient cooling group; c . Acute cooling group; d . Natural cooling of crush ice group; BC. Before cooling; AC. After cool i ng; black arrows indicate changes in the intermuscular space, and red arrows indicate changes in muscle fiber rupture. 表 4 冷胁迫方式对虾夷扇贝保活期间主要营养物质的影响 Table 4 Effect of cold stress on main nutrients of P. yessoensis during keep alive period 组别 Group 水分质量分数 Moisture mass fraction/% 粗蛋白质量分数 Crude protein mass fraction/% 粗脂肪质量分数 Crude fat mass fraction/% 肌糖原质量分数 Muscle glycogen mass fraction/(mgg) 肌乳酸质量摩尔浓度 Lactate molality/ (mmolg) 降温前 Before cooling 69.24±0.61 18.49±0.69 2.88±0.15° 19.33±0.17* 6.53±0.38 散冰组 69.06±0.39° 18.08±0.78 2.37±0.59° 17.61±0.34” 12.37±0.59" 降温后 After cooling 急性组 69.90±0.62 18.46±0.50 2.13±0.09 17.51±0.42° 10.46±0.56° 梯度组 70.30±0.68 18.64±0.53 2.29±0.15* 18.92±0.27* 9.62±0.42” 散冰组 67.13±1.00° 13.46±0.59° 1.39±0.34° 14.56±0.31° 17.52±0.48 Keep alive for 3 d 急性组 62.91±0.58° 15.48±0.92aD 1.46±0.07° 15.82±0.41” 13.75±0.72” 梯度组 63.79±0.49° 16.91±1.23 1.88±0.21 17.30±0.49 12.23±0.12 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (P <0.05)。 Note: Values with different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). 度降温组有显著性差异，水分、粗蛋白质量分数与 梯度降温组无显著性差异。 讨论 3.1 冷胁迫诱导休眠方式对虾夷扇贝心电图的影响 目前，通过捕获红外信号测定海洋无脊椎动物 心率的方法已有较多报道，该方法具有快速、准 确、可靠、稳定等特点，且测定过程对贝类生物体 无损伤，已广泛应用于缢蛏 (Sinonovacula cons -tricta)[18]、杂交鲍19、长牡蛎 (Crassostrea gigas)20]蛤蜊 (Paphia undulata )[21]的养殖、育种、抗性评估 等研究。心电图体现了贝类心脏收缩和舒张的变 化，进一步体现了心脏对各个器官组织的供血和供 氧能力。已有研究表明，虾夷扇贝单一个体的心率 具有规律性和周期性 (22]，而贝类自身的规格、年 龄以及环境温度、盐度、食物等均会对其心脏性能 产生影响。其中，温度是影响贝类心率的主要环境 因子。本研究发现，温度突变对虾夷扇贝心率有较 大影响。降温前，虾夷扇贝保持平稳有规律的心脏 跳动，经过急性降温和散冰降温后，其心脏跳动由 规律跳动变为无规律跳动，心跳出现紊乱甚至停止 跳动，表明温度突变对扇贝机体造成一定损伤，心 脏无法在短时间内恢复正常的供氧供血平衡，进一 步影响到心脏活动。梯度降温属于有序缓慢的降温 过程，在降温过程中虾夷扇贝心率随温度的降低呈 现以一定速率下降的趋势，说明随着温度的降低扇 贝机体新陈代谢速率逐步减缓，心脏跳动频率慢，血液循环量小，进一步说明了低温使扇贝进入休眠 状态。Liang 等[23]研究表明,杂色鲍(Haliotis di-versicolor 在短期低温胁迫下其心率随温度的降低 出现线性下降的趋势；长牡蛎幼体在冷驯化过程中 心脏主动收缩，心脏跳动变缓或有搏动停止的现 象 [24]。心脏振幅代表心室收缩峰值，本研究发 现，在梯度降温过程中心脏振幅与温度呈负相关关 系，说明在降温过程中虾夷扇贝心脏收缩强度缓慢 上升，这可能是低温对其造成了一定胁迫。Xing 等 125]研究研究指出，栉孔扇贝心脏振幅在海水温 度上升期间逐渐增加，达到峰值以后急剧下降。由 此推断，扇贝心脏振幅可能与机体所受的胁迫程度 相关。 目前对贝类保活期间心脏活动变化的相关研究 尚未见报道。本研究发现，保活期间虾夷扇贝心率 显著高于保活前，这可能是由于保活期间测定心率 时将扇贝从 44℃无水休眠环境置于 44℃有水环境 中缓慢升温至 115℃所致，环境的变动以及升温过 程对扇贝机体造成生理应激反应，进一步加快了心 脏收缩与舒张，促进了血液循环。ao 等 [26]研究 指出温度变化会导致华贵栉孔扇贝 ((C. nobilis )心 率加快，且能加速其心脏收缩速度和提高血液瞬时 流量。本研究中，保活期间扇贝心率逐渐降低，保 活 33d 后散冰降温组已无规律的心电图，这可能是 扇贝在保活休眠期间受到干露、缺氧、低温和饥饿 等逆环境胁迫，其在应答胁迫时伴随着相应脏器结 构的损伤，其中散冰降温对其造成了不可逆损伤， 进一步导致其心脏跳动失调。 3.2 心率与外套膜响应时间相关性 扇贝产业实际流通中，缩边率、外套膜响应时 间是简便、高效、直观判断扇贝活力的指标，但存 在判断结果不准确以及对机体造成损伤等缺点。本 研究引入了心率这一新指标，为了判断心率是否能 够反映虾夷扇贝保活流通过程中的生命特征，将心 率、心脏振幅、缩边率、外套膜响应时间进行相关 性分析。结果表明，心率与外套膜响应时间呈显著 负相关关系，说明心率是可用于评价保活流通过程 中虾夷扇贝生命力强弱的一个指标。同时，在实验 中发现了一个现象，部分扇贝在保活后期无法监测 到规律的心率但刺激外套膜有内缩或缓慢闭壳等响 应，说明该扇贝活力较弱可能处于濒死状态。有研 究表明，缩边程度与外套膜刺激响应时间呈正相关 关系，外套膜刺激响应时间越长缩边率越高，扇贝 状态越差活力越弱115。 综上，心率与外套膜响应时间可直观反映虾夷 扇贝的活力，本研究结合心率强弱及外套膜响应时 间将保活流通过程中虾夷扇贝的活力细分为 5个等 级(表5)。 表 5 保活期内活品虾夷扇贝的活力等级 Table 5 Vitality levels of P. yessoensis during keep alive period 等级 心率 外套膜响应时间 Grade Heart rate/(次·min) Mantle response time/s 一级 First rate 25~27 0~2 二级 Second rate 22~24 3~5 三级 Third rate 20~23 6~8 四级 Fourth rate 无规律 9~11 五级 Fifth rate 无规律 >15 3.3 冷胁迫诱导休眠方式对虾夷扇贝营养品质指 标的影响 贝类在无水保活期间需要一定的能量物质维持 机体的生命活动，机体自身受胁迫程度越深其耗能 越多，短期胁迫时贝类可通过自身调节维持体内新 陈代谢平衡，长期胁迫下超过贝类自身调节的阈值 会导致代谢失衡 2271，逐步消耗机体营养物质甚至 死亡。糖原既是贝类的储能物质也是部分呈味物质 的来源，当环境变化贝类受到胁迫时将优先消耗糖 原。菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum 在饥饿 环境下为维持其正常生命活动其糖原利用率高达 60%~70%28]。本研究表明,虾夷扇贝受到散冰降 温和急性骤冷降温时，糖原首先被消耗并伴随着乳 酸的累积，说明这两种降温方式均对虾夷扇贝造成 了较大胁迫，进一步反映梯度降温是一种有序、缓 慢的降温休眠方式，更有利于虾夷扇贝保活流通；随着保活时间的延长，粗脂肪、粗蛋白也出现不同 程度的消耗，说明短期胁迫下首先消耗糖原，随着 胁迫时间的延长和程度的加深，粗脂肪、粗蛋白会 进一步被贝类分解利用。这与陈文秀等 (29]、闫丽 新等 330]的研究结果一致。 4 结论 本研究通过模拟虾夷扇贝实际运输，探讨了保 活运输前不同冷胁迫诱导休眠方式对其保活流通过 程中成活率、生命特征及营养品质指标的影响。结 果表明梯度降温方式对保活期间虾夷扇贝成活率的 影响较小,保活3d后成活率达93.33%;同时在保 活期有较明显的生命特征，主要表现为缩边率较 小、外套膜响应时间较短、规律有力的心电图，且 主要营养物质损失较少。采用无损检测扇贝心率作 为保活流通过程中的一个生命特征指标，结合外套 膜响应时间，改善了活品虾夷扇贝分级不足的现 状，并为双壳类保活过程中的活力评判提供了新指 标。值得指出的是，本研究在测定虾夷扇贝心电图 时发现，在低温状态下难以监测到规律稳定的心电 图，这可能由低温导致虾夷扇贝心脏跳动频率减慢 所致，而随着温度缓慢上升则可监测到规律稳定的 心电图。因此，保活过程中虾夷扇贝的心脏活动值 得今后深入探讨。研究结果为虾夷扇贝保活前降温 休眠工序提供了理论参考。 参考文献： [1] 农业农村部渔业渔政管理局 ,全国水产技术推广总站 ,中国水 产 学会.2021中 国 渔业统计年鉴[M].北京:中 国 农业出版社,2021:17-20. [2]CCHEN L, SHI H, ZHANG X, et al. The effec t of depuration sali-nity on the survival, nutr i tional composition, biochemical re-sponses and proteome of Pacific oyster (Crassostrea gigas ) during anhydrous l iving-preservat i on [J ]. Food Control, 2022, 138:108977. [3] CHEN S Q, ZHANG C, XIONG Y F, et al. A GC-MS-based meta-bolomic s i nvestigation on scallop (Chlamys farreri) during semi-anhydrous l iving-preservation[J ]. Innov Food Sci Emerg Technol ,2015,31:185-195. [4] XU T Y , LI Y X, TIAN Y T , et al. Effects of post-harvest hypoxic stress on post -l anding recovery of l i ve scallops (Mizuhopecten yes -soensis) revealed by untargeted metabolomics based on UPLC-Q-TOF -MS[J]. Food Control, 2021,123:107671. [5]ZAMORA LN,RAGGNLC, HILTON Z, et al . Emersion survi-val manipulation in Greenshellmussels (Perna canaliculus): i m-pl i cations for t he extension of l i ve mussels' she l f -life[J]. Aquacul -ture, 2019, 500:597-606. [6] 赵前 ,周进 ,刘俊荣 ,等 .水产品鲜活品质评价体系研究进展 [刀].大连 海 洋大学学报,2021,36(4):706-716. [7] DEPLEDGE M H, ANDERSEN B B. A computer -aided physiolo -g i cal monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac ac t ivity in selected invertebrates[J. Comp Biochem Physiol A, 1990,96(4):473-477. [8] YU F, WU Y Y , SHEN Y W, et al . Heat adhesion duration: a new high-throughput abalone thermal tolerance assessment method [J ]. Aquaculture, 2021, 545:737226. [9] CHEN N, SHEN Y W, YU F, et al . A new i ndicator of hypoxia tole-rance in abalone, developed based on heart rate fluctuations[J]. Aquaculture, 2020,519:734903. [[1100]] RANA M, RAHMAN A, HUGO D, et al . Investigating data -dr i-ven approaches to understand the interaction between water qua-l i ty and physiological response of sentinel oysters in natural envi -ronment[J. Comput Electron Agric, 2020, 175:105545. [[1111]] XING Q, WANG J, HU L P, et al. Seasonal variation of the thermal tolerance indicator ABT and the development of a rapid detection method in scallop Chlamys farreri[J]. Aquaculture,2021,531:735960. [12]林恒宗 ,高加龙 ,梁志源 ,等 .冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保 活期氧化应激及能量消耗的影响 [J]. 广东 海 洋大 学学 报,2022,42(2):95-103. [[1133]] BAKHMET I, ARISTOV D, MARCHENKO J , et al . Handling the heat: changes i n the heart rate of two congeneric blue mussel spe -cies and their hybrids in response to water temperature[J]. J Sea Res, 2022, 185:102218. [[1144]] CHEN X L, LYU M, GAN H, et al. Impact of chitosan-based coat- ings on myofibr i llar protein denaturation, muscle microstructure and l ipid oxidation of oyster (Crassostrea hongkongensis) during 0degrees C storage [J ]. J Aquat Food Prod Technol, 2020, 29(10):1001-1012. [15]李亚 恒 ,刘俊荣 ,周进 ,等 .基于束缚的胁迫调控对潜水采捕虾 夷扇贝活品贮运稳定性的影响 [J].水 产 学报,2022,46(4):605-615. [16]徐德峰  ,吴嘉鑫  ,孙力军  ,等 .急冷与空气暴露联合胁迫对凡纳 滨对虾生理代谢影响 [J ].广 东 海 洋大学学报,2022,42(1):20-28. [[1177]] PENG L, YOU J , WANG L, et al. Insight into the mechanism on texture change of Wuchang bream muscle during live transporta-tion us i ng a UPLC-QTOF-MS based metabolomics method[刀]. Food Chem, 2023,398:133796. [18]胡凌威 ,孙长森 ,董迎辉 ,等 .缢蛏 (Sinonovacula constricta 心 率 Arrhenius 拐点温度(ABT)及其与生长性状相关和通径分 析[J].海洋与湖沼,2021,52(5):1265-1272. [[1199]] ALTER K,ANDREWARTHA S J, MORASH A J, et al . Hybrid aba- lone are more robust to multi-stressor environments than pure parental species [J ]. Aquaculture, 2017,478:25-34. [[2200]] GHAFFARI H, WANG W, LI A, et al. Thermotolerance diver - gence revealed by the physiological and molecular responses in Crassostrea gigas Physiol , 2019, 10:01137. [[2211]] ZHANG PF,ZHAO T,ZHOU L, et al. Thermal tolerance traits of the undulated surf clam Paphia undulata based on heart rate and physiological energetics [J ]. Aquaculture, 2019, 498:343-350. [22]刘超 ,吴富村 ,林思恒 ,等 .高温刺激导致虾夷扇贝死亡因素的 探究 [J].海洋科学,2016,40(11):91-98 [[2233]] LIANG S,YOU W W, LUO X, et al. Cardiac and respiratory meta- bolic analysis of low-temperature tolerance in two geographic genotypes of Haliot i s diversicolor and the hybrid[J ]. Aquac Rep 2021,21:100869. [[2244]] DOMNIK N J, POLYMEROPOULOS E T, ELLIOTT N G, et al. Automated non-invasive video-microscopy of oyster spat heart rate during acute temperature change: impact of acclimation tem-perature[J]. Front Physiol, 2016,7:00236. [[2255]] XING Q, ZHANG L L, LI Y Q, et al . Development of novel cardi- ac indices and assessment of f actors affec t ing cardiac ac t ivity in a bivalve mollusc Chlamys farrer i [J]. Front Physiol , 2019, 10: 00293. [[2266]] HAO Y, SUN C Y, RONG Y, et al . Circulatory and metabolic physiology disorder in different organs of the subtropical scallop Chlamys nobilis vealed by doppler ultrasonography technique [J ]. Front Mar Sci,2022,9:880112. [27]林恒宗 ,高加龙 ,梁志源 ,等 .暂养净化及无水保活中太平洋牡 蛎活力品质 与呈 味物质分析[J].食品科学,2023:1-12. [[2288]] BI S, XUE C H, SUN C, et al. Impac t of transportation and rehyd-ration strategies on the physiological responses of clams (Ru-ditapes philippinarum)[J]. Aquac Rep, 2022, 22: 100976. [29]陈文秀 ,欧阳杰 ,徐文其 ,等 .贮藏条件对活品虾夷扇贝营养及 品 质 的影响 [J].渔业现代化,2019,46(6):83-89. [30]闫丽新 ,田元勇 ,姜明慧 ,等 .无水运输 -湿藏销售中虾夷扇贝 活力和 呈 味特性变化[J ].水产科学,2022,41(1):44-51.