猪肉中替扎尼定、赛拉嗪、溴莫尼定、安普乐定、可乐定检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-066Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-458 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定猪肉中5种az-受体激动剂 LCMSMS-458 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8050，建立了动物源性食品中替扎尼定等5种az-受体激动剂的测定方法。参考《GB31660.6-2019 动物性食品中5种a-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，猪肉样品经用碳酸钠缓冲溶液、乙酸乙酯提取， SHIMSEN StyraMCX(岛津实验器材有限公司，P/N： 380-00853-01) 固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均≥0.995，5 ug/kg加标回收率在69.6%~91.8%之间，相对标准偏差(RSD)<5.7%。该方法可满足猪肉样品中αs-受体激动剂的定量。 关键词： LCMS-8050兽药残留猪肉az-受体激动剂 社会各界对“瘦肉精”食品安全问题的关注，促使了β-受体激动剂的检测技术得到了飞速发展，从而有效遏止了β-受体激动剂在动物养殖中的非法使用。而as-受体激动剂作为一种新型的具有促进生长及提高瘦肉率作用的药物也在逐步引起关注，且在饲料行业中已有非法添加使用的趋势。早在2010年，农业部1519号公告已明确把可乐定、赛庚啶等列入了农业部《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单。《GB 31650-2019食品中兽药最大残留限量》规定， 仅赛拉嗪可用于非产奶期的牛、马等动物，其他αs- 受体激动剂均禁止用于畜禽养殖，且不得检出。 《GB 31660.6--2019动物性食品中5种a-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，提供了替扎尼定、赛拉嗪、溴莫尼定、安普乐定和可乐定在猪、鸡肌肉及内脏中残留检测方法，该标准已于2020年4月1日正式实施。本文参考《GB 31660.6-2019 动物性食品中5种az-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，建立了基于LCMS-8050的猪肉中5种αz受体激动剂的测定方法。该方法快速、稳定，适合动物性食品中替扎尼定等5种αs-受体激动剂的测定。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质极仪联用系统LCMS-8050。具体配置为 LC-30AD×2(输液泵)，DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器))，， CTO-30A(柱温箱)， CBM-20A系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (100mm×2.1 mm I.D.， 1.8 um) Shimadzu SGLC， P/N： 227-32010-04 流动相：流动相A-0.2%甲酸水溶液流动相B-乙腈 流速： 0.3mL/min 柱温：35℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 4.00 Pumps Pump B Conc. 30 4.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.60 Pumps Pump B Conc. 10 8.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 加热模块温度：300℃ 离子源： ESI+雾化气流速：3.0 L/min加热气流速：10.0L/min DL温度：250℃ 离子源温度：400℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0L/min MRM参数：见表2 表 2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE Q3 Pre Bias (V) 替扎尼定 254.00 44.10* -19.0 -26.0 -16.0 210.00 -10.0 -28.0 -20.0 2 赛拉嗪 221.10 90.00* -16.0 -23.0 -16.0 164.10 -17.0 -26.0 -29.0 3 溴莫尼定 292.00 170.00* -11.0 -35.0 -17.0 212.00 -22.0 -28.0 -21.0 4 安普乐定 245.00 174.10* -18.0 -28.0 -17.0 209.00 -10.0 -23.0 -21.0 5 可乐定 230.00 159.90* -17.0 -34.0 -28.0 213.00 -18.0 -24.0 -21.0 *定量离子对 1.3标准品及试剂 标准品：盐酸替扎尼定 (Tizanidine hydrochloride，C，HgCIN，S·HCI，CAS：64461-82-1)、溴莫尼定(Brimonidine，CnH10BrNs， CAS：59803-98-4)、盐酸安普乐定 (Apraclonidine hydrochloride，C，H10NaCI·HCI，CAS：73218-79-8) 和盐酸可乐定 (Clonidine hydrochloride，C，H1oClN3， CAS：4205-91-8)，含量均≥98%， 购自中检院。盐酸赛拉嗪(XylazineHydrochloride，C2H16NzS， CAS：7361-61-7)，含量≥98%，购自TRC公司。 试剂： SHIMSEN Styra MCX(SGLC 货号，380-00853-01)固相萃取柱，室温保存。 乙腈：色谱级，室温保存。 超纯水：蒸馏水由Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 碳酸钠缓冲溶液：取无水碳酸钠10.6 g，用水溶解并稀释至100 mL， 为A液；取碳酸氢钠8.4 g， 用水溶解并稀释至100mL， 为B液。取A液90mL、B液10mL， 混匀，现用现配。 1.4样品及标准曲线配制 1.4.1样品制备 参考《GB 31660.6-2019 动物性食品中5种αz-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》标准前处理方法：取试料2g(准确至±20mg)，，于50mL离心管中，加碳酸钠缓冲液5mL，振荡混匀，加乙酸乙酯10mL，充分振荡，于8000 r/min 离心5 min， 取上清液于鸡心瓶中，下层溶液中加乙酸乙酯10mL重复提取一次，合并两次上清液。于55℃旋转蒸发至干，加初始流动相溶液4.0mL溶解残余物，备用。SHIMSEN Styra MCX(SGLC 货号，380-00853-01)固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL活化。取备用液过柱，用水3mL、甲醇3mL分别淋洗，抽干，5%氨水甲醇溶液6mL洗脱，收集洗脱液，并用5%氨水甲醇定容至6mL，上机。 1.4.2标准曲线制备 分别精密量取混合标准工作液适量，用初始比例流动相稀释配制成浓度为0.5、1、2、10、50和 100 ug/L系列混合标准工作液，临用现配。 结果讨论 2.1标品质谱图与色谱图 将100 ug/L 混标溶液进样分析，采用产物离子扫描模式确认替扎尼定等5种az-受体激动剂的碎片离子，如下图1所示，可找到标准推荐的产物离子。对空白溶剂和 0.5 ug/L混标溶液分析，MRM 色谱图如图2所示，空白溶剂无干扰，且5种az-受体激动剂在4 min 内实现了良好分离。 Inten.(x100，000) 图1 5种a-受体激动剂 MS2 质谱图 图2 空白溶剂(a)、0.5ug/L混标(b)色谱图 2.2线性关系及检出限、定量限 对系列混合标准曲线溶液进行分析，以面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性拟合。结果如表3和图3所示，替扎尼定等5种目标物在0.5-100 ug/L范围内，线性良好，线性相关系数均≥0.995。以0.5 ug/L数据为依据，根据信噪比 S/N=3、S/N=10计算检出限(LOD)、定量限(LOQ)，检出限和定量限均低于 0.44 ug/kg， 满足标准要求。 浓度 图3 标准曲线 表3 标准曲线、检出限及定量限 序号 相关系数 准确度 检出限 定量限 中文名称 线性方程 r (%) (ug/kg) (ug/kg) 1 替扎尼定 Y=(58001.0)X+(8238.45) 0.995 89.0-111.4 0.04 0.10 2 赛拉嗪 Y=(85806.3)X+ (6096.82) 0.999 95.7-104.2 0.02 0.06 3 溴莫尼定 Y=(34668.4)X+(3641.28) 0.998 91.7-107.6 0.04 0.12 4 安普乐定 Y=(42533.9)X+(4399.56) 0.997 90.7-108.8 0.06 0.18 5 可乐定 Y=(5687.90)X+(666.671) 0.997 90.7-110.3 0.14 0.44 2.3重复性考察 对1 ug/L的标准溶液连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD。结果见表4，保留时间 RSD<0.27%，峰面积的 RSD<4.86%。仪器稳定性良好。 表4 保留时间和面积RSD 序号 中文名称 保留时间 RSD(%) 面积RSD (%) 1 替扎尼定 0.08 1.69 2 赛拉嗪 0.05 1.91 3 溴莫尼定 0.17 4.05 4 安普乐定 0.27 4.86 5 可乐定 0.08 4.81 2.4加标回收率考察 在空白猪肉样品上进行2 ug/kg 的加标回收试验，平行3份。结果见表5，替扎尼定等5种目标物平均回收率在69.6%~91.8%之间，RSD 均<5.7%。完全满足标准对于回收率的要求(60%~100%)。 表5猪肉加标回收率结果 序号 中文名称 低水平((2pg/kg) 加标回收率/% 重复性/% 替扎尼定 87.2 3.3 2 赛拉嗪 78.7 2.7 3 溴莫尼定 81.9 3.5 4 安普乐定 69.6 2.7 5 可乐定 91.8 5.6 结论 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8050， 参考 GB 31660.6-2019标准，建立了猪肉中5种a-受体激动剂测定方法。该方法可供相关行业参考。 岛津应用云 使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8050，建立了动物源性食品中替扎尼定等5种α2-受体激动剂的测定方法。参考《GB 31660.6—2019 动物性食品中5种α2-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，猪肉样品经用碳酸钠缓冲溶液、乙酸乙酯提取，SHIMSEN Styra MCX (岛津实验器材有限公司，P/N: 380-00853-01)固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均≥0.995，5 μg/kg加标回收率在69.6%～91.8%之间，相对标准偏差(RSD)< 5.7%。该方法可满足猪肉样品中α2-受体激动剂的定量。