食品（肉类、蛋和牛奶）中氨基糖苷类抗生素残留检测方案(液相色谱仪)

LAAN-A-LM-E145 ApplicationnNNo.C175News 岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2018年5月400-650-0439 ApplicationNews LC/MS No.C175 快速定量分析肉类、蛋和牛奶中的氨基糖苷类抗生素残留，并用 MRM 扫描模式进行化合物确认 氨基糖苷类抗生素(AG)属于抗生素产品，广泛用于治疗牛、羊、猪和家禽的细菌感染。它们具有广谱活性，可用于抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。 AG 具有耳毒性和肾毒性，但由于价格低，并没有妨碍它在兽医应用中的广泛使用。 AG 对组织具有高度的亲和力，如果没有遵守停药期或使用不当，它们可能会出现在肉类、牛奶或蛋中。因此，吃含氨基糖苷类抗生素的食物对人体健康有潜在危害。 监管机构已为这些兽用化合物设定了最大残留限量(MRL)。 氨基糖苷类抗生素属于极性很强的化合物，难以通过反相液相色谱保留。 选择离子对试剂并不理想，因为其容易污染分析系统并干扰其蛇方法。 对此，已开发出一种方法包来克服这些难题。其中包括从各种产品中制得纯净提取物的方法，以及使用亲水相互作用液相色谱(HILiC)结合三重四杆杆质谱检测的快速定量方法。必要时，在无需更换试剂的情况下，可以使用另外一种方法MRM 扫描模式进行正式峰鉴定。 本文中，我们报告了使用该方法包来评估多种肉类样品和牛奶的安全水平。 ( Mikael Levi， 日本京都市岛津制作所。 ) 图1.本文涉及的氨基糖苷类抗生素 样品制备 肉类样品(神户牛肉、鸡胸肉和鸡肝、猪排)和牛奶均从当地超市购买。研磨后，依据方法包中的说明处理5g样品。简而言之，添加内标物(核糖霉素)后，用酸性缓冲液分两次提取化合物。然后，利用弱阳离子交换作用纯化提取物，并在进样前稀释5倍(5uL)。另外，按日本厚生劳动省规定的0.5倍和1.5倍MRL(最大残留限量)加标各个样品。 除了0.5倍 MRL加标水平的牛肉样品制备6次以外，所有样品均制备一次。 LC-MS/MS分析 使用方法包中的 LC-MS/MS 条件和即用型方法测定纯化的提取物。使用流动相溶解的校准曲线定量样品。 首先，使用快速定量法来测定样品。该方法在 HILiC 条件下用乙腈和甲酸盐缓冲液对化合物进行梯度洗脱。分析的周期时间为4.5分钟。在多反应监测(MRM)模式下进行检测，每个化合物采集2个离子对。 对阳性样品(即，超过MRL)的纯化提取物进行二次进样，从而评估峰的同一性。为此，采用了第二种方法，该方法具有相同的色谱柱和流动相，但梯度有所不同，且每种化合物 (ISTD除外)选先15个MRM 离子对。 分析系统为 NexeraTM X2 UHPLC 与 LCMS-8060 三重四极杆质谱仪的联用系统。用 LabSolutions InsightM v.3.1在筛选选项下进行数据处理。 结果 MRL视种类和产品而有所不同。根据日本现行规定，如果没有对兽药残留的 MRL做出正式规定，则对于任何被测化学物质，均应考虑将默认’MRL 设为 10 ug/kg。将安普霉素、二氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素和链霉素的校准曲线范围设为涵盖最低 MRL 的 10%到最高MRL的150%。将没有正式规定 MRL的其他化合物的校准范围设为10 ug/kg 的20%至150%。表1中列出了校准曲线浓度值。评估了在该范围内定期使用的七个校准级别。选择准确度范围介于85-115%的校准标准品。图2列出了代表性校准曲线。 未加标的样品显示不含氨基糖苷类抗生素残留物。然后，使用计算的浓度计算加标样品的回收率。表2中列出了计算结果。所有化合物和所有类型样品的回收率均在70-120%的可接受范围内。利用0.5×MRL水平加标的牛肉样品评估重复性。结果见表 3。%RSD 小于20%，说明适合此类应用。 图3显示了质谱图示例。 表1.所选样品在日本的最大残留限量和相应校准曲线范围 校准曲线范围 低 MRL 高MRL LLOQ LLOQ ULOQ ULOQ (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg) (ng/mL) (ug/kg) (ng/mL) 阿卡米星 无值 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 安普霉素 60 500 6 0.3 750 37.5 二氢链霉素 200 600 20 1.0 900 45.0 庆大霉素(总和) 100 200 10 0.5 300 15.0 潮霉素 无MRL 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 卡那霉素 40 500 4 0.2 750 37.5 新霉素 500 500 50 2.5 750 37.5 奈替米星 无 MRL 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 巴龙霉素 无 MRL 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 西索米星 无 MRL 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 大观霉素 200 2000 20 1.0 3000 150.0 链霉素 200 600 20 1.0 900 45.0 妥布霉素 无 MRL 默认值(10) 2 0.1 15 0.75 表2.加标样品中的计算回收率 AMI APRA DHSTP GENT C1a GENT C1 GENT C2/C2a HYGRO KANA 牛奶 91.9% 88.7% 108% 76.6% 89.4% 83.3% 94.3% 100% 0.5 x MRL 牛肉 107% 89.0% 117% 90.4% 94.2% 95.2% 107% 102% 猪肉 88.3% 98.9% 114% 80.4% 86.3% 87.6% 96.5% 88.7% 时的回收率 鸡胸肉 82.2% 90.3% 97.4% 98.7% 92.4% 90.3% 105% 94.8% 鸡肝 70.9% 91.5% 103% 91.3% 80.8% 86.1% 99.4% 101% 牛奶 83.0% 99.0% 106% 85.8% 91.0% 101% 91.8% 98.1% 1.5 x MRL 牛肉 89.9% 95.9% 96.9% 98.8% 91.2% 95.5% 104% 96.1% 猪肉 86.3% 89.5% 98.5% 95.1% 102% 96.9% 112% 97.2% 时的回收率 鸡胸肉 82.2% 90.3% 97.4% 98.7% 92.4% 90.3% 105% 94.8% 鸡肝 87.8% 90.7% 90.7% 99.5% 85.5% 88.8% 91.6% 83.8% NEO NETIL PARO SISO SPC STP TOB 牛奶 81.2% 101% 73.3% 75.3% 94.0% 111% 91.0% 0.5 x MRL 牛肉 91.4% 101% 88.1% 88.4% 110% 114% 91.5% 猪肉 85.7% 91.0% 90.7% 76.4% 101% 111% 85.8% 时的回收率 鸡胸肉 94.1% 90.5% 78.4% 84.9% 92.7% 102% 107% 鸡肝 78.6% 90.8% 76.5% 78.8% 101% 108% 92.5% 1.5 x MRL 时的回收率 牛奶 96.7% 93.6% 86.9% 99.4% 94.8% 105% 102% 牛肉 113% 91.1% 103% 106% 86.9% 93.1% 105% 猪肉 106% 90.4% 94.8% 94.3% 95.2% 105% 108% 鸡胸肉 94.1% 90.5% 78.4% 84.9% 92.7% 102% 107% 鸡肝 109% 82.4% 89.5% 95.3% 75.3% 90.0% 98.1% 图2.代表性校准曲线 图3.针对每种化合物以50% MRL 加标的鸡肝样品 AMI APRA DHSTP GENT C1a GENT C1 GENT C2/C2a HYGRO KANA 浓度平均值(ug/kg) 5.38 225 350 45.6 47.5 48.0 5.32 21.1 回收率 107% 89.0% 117% 90.4% 94.2% 95.2% 107% 102% %RSD 19.9% 7.7% 10.0% 10.8% 10.2% 6.9% 7.1% 12.0% NEO NETIL PARO SISO SPC STP TOB 浓度平均值 (ug/kg) 228 5.03 4.39 4.47 275 348 4.66 回收率 91.4% 101% 88.1% 88.4% 110% 114% 91.5% %RSD 8.8% 10.0% 8.1% 4.4% 11.0% 11.9% 6.2% 1结果(续) 为了增加超过 MRL 的化合物鉴定的精准度，可以将提取物再次进样，使用另外一种方法进行分析，延长梯度时间，并针对每种化合物选择15个MRM 离子对。然后，合并MRM信号以生成在最佳碰撞能量下的 MRM 扫描谱。 下面显示了 LabSolutions Insight 在筛选选项下搜索结果的示例(图4)。可以在批表模式下自动完成样品处理和谱库检索。在此情况下，可以获得较高的鉴定分数。二氢链霉素得分为95，而第二条筛选结果中的化合物(链霉素，结构非常相似的化合物)得分仅为51。 l结论 新开发的方法包成功用于真实肉类和牛奶样品的鉴定。即使对于痕量水平下的非监管化合物，定量方法也获得了较高的回收率和准确度，无需使用对应的基质标曲即可将其用于各种不用的样品。 利用 MRM 扫描模式的补充方法提高了超限化合物鉴定的精准度。 图4. 1.5×MRL加标牛奶样品中二氢链霉素MRM 扫描的频谱检索结果 岛津应用云 LCMS 及 Nexera 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家所使用的商标。Traverse MS 是 Life Fix 株式会社的商标。 ( 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 氨基糖苷类抗生素（AG）属于抗生素产品，广泛用于治疗牛、羊、猪和家禽的细菌感染。它们具有广谱活性，可用于抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。AG具有耳毒性和肾毒性，但由于价格低，并没有妨碍它在兽医应用中的广泛使用。AG对组织具有高度的亲和力，如果没有遵守停药期或使用不当，它们可能会出现在肉类、牛奶或蛋中。因此，吃含氨基糖苷类抗生素的食物对人体健康有潜在危害。监管机构已为这些兽用化合物设定了最大残留限量（MRL）。氨基糖苷类抗生素属于极性很强的化合物，难以通过反相液相色谱保留。选择离子对试剂并不理想，因为其容易污染分析系统并干扰其它方法。对此，已开发出一种方法包来克服这些难题。其中包括从各种产品中制得纯净提取物的方法，以及使用亲水相互作用液相色谱（HILiC）结合三重四极杆质谱检测的快速定量方法。必要时，在无需更换试剂的情况下，可以使用另外一种方法MRM扫描模式进行正式峰鉴定。本文中，我们报告了使用该方法包来评估多种肉类样品和牛奶的安全水平。