猪肉中赛庚啶、二苯拉林、可乐定、可乐定-D4检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-068Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-459 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 测定猪肉中赛庚啶和可乐定 LCMSMS-459 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪 LCMS-8045，建立了动物源性食品中赛庚啶和可乐定分析方法。参考《GB 31660.7-2019 猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，猪肉样品经酸性乙腈提取，氮吹浓缩，流动相初始比例溶液复溶，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。结果显示赛庚啶和可乐定线性良好，标准曲线相关系数均≥0.995， 1 ug/kg、10 ug/kg 浓度的加标回收率在70.6~97.6%之间，加标回收率相对标准偏差(RSD)<5.6%。该方法可满足猪肉样品中赛庚啶和可乐定的定性定量测定。 关键词：LCMS-8045兽药残留猪肉可乐定 赛庚啶 赛庚啶是一种H1受体拮抗剂，临床上用于荨麻疹、湿疹、过敏性和接触性皮炎，同时，赛赛啶具有抗5-羟色胺的作用，可抑制下丘脑饱觉中枢而刺激食欲增加体重，用于畜禽养殖可以促进生长。. 可乐定是一种az-受体激动剂，属于咪唑啉衍生物，在临床上，具有显著促进激素水平升高的作用，在畜禽养殖中使用可促进腺垂体生长激素分泌，提高生长性能，改善体品质。这两种化合物是市场上发现的新型违禁添加物。 早在2010年，农业部1519号公告已明确把可乐定、赛庚啶等列入了农业部《禁止在饲料和动物饮 水中使用的物质》清单。2019年10月发布了《GB31650-2019食品中兽药最大残留限量》，将“不再收载禁止药物及化合物清单”，2020年4月1日起执行。这表明，赛庚啶和可乐定均不得用于动物养殖，且不应在动物性产品中检出。 本文参考《GB 31660.7-2019 猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，建立了基于岛津 LCMS-8045的猪肉中赛庚啶和可乐定的测定方法。该方法快速、稳定，适合动物性食品中赛庚啶和可乐定的测定。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱与三普四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为 LC-20ADxR×2(输液泵)，DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-20ACMP (自动进样器)， CTO-20AC (柱温箱)， CBM-20A系统控制器，LCMS-8045三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shimadzu Shim-pack Velox C18 (100mm×2.1mml.D.， 1.8 um) Shimadzu SGLC， P/N：227-32010-04 流动相：流动相A-0.1%甲酸水溶液流动相B-乙腈 流速： 0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 4.00 Pumps PumpB Conc. 60 4.50 Pumps Pump B Conc. 95 5.50 Pumps Pump B Conc. 95 5.60 Pumps Pump B Conc. 20 8.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8045 离子源：ESI+雾化气流速：3.0L/min 加热气流速：10.0L/min 干燥气流速：10.0L/min 加热模块温度：300CDL温度：250℃离子源温度：400℃扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 288.20 191.00* -13.0 -30.0 -19.0 赛庚啶 215.00 -14.0 -51.0 -20.0 2 二苯拉林(内标) 282.20 116.10 -12.0 -32.0 -11.0 3 可乐定 230.10 159.80* -19.0 -37.0 -28.0 213.00 -16.0 -23.0 -21.0 4 可乐定-D4(内标) 234.10 216.90 -11.0 -26.0 -22.0 *定量离子对 1.3标准品及试剂 标准品：盐酸赛庚啶 (Cyproheptadine hydrochloride，C21H21N·HCI， CAS 号：969-33-5)、盐酸可乐定(Clonidine hydrochloride，C，H10Cl，N3， CAS 号：4205-91-8)：含量均≥98.0%，购自中检院。盐酸二苯拉林 (Diphenylpyraline，CgH13NO·HCI， CAS号：61-76-7)、 盐酸可乐定-D4(Clonidine-D4 hydrochloride，C，HD4CIN3)：含量均≥98%， 购自TRC公司。 试剂： WondaSepC18粉末，购自岛津实验器材有限公司(SGLC)，室温保存。 乙腈：色谱级，室温保存。 实验用水：由 Milli-Q Plus 水净充系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 1.4样品及标准曲线配制 1.4.1样品制备 参考 《GB31660.7-2019猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定残留量的测定液相色谱-串联质谱法》示准前处理方法：取试料2g(准确至±20mg)， 于50mL离心管中，加50 uL混合内标工作液，加C18粉0.5g，振荡混匀，加1%甲酸乙腈10mL， 充分振荡，于 8000 r/min 离心5 min， 取上清液，. 于离心管中，50℃水浴氮气吹干。加流动相初始比例溶液1.0 mL使溶解， 0.22 um 滤膜滤过，液相色谱-串联质谱仪测定。 1.4.2标准曲线配制 1.4.2.1标准储备液 (1mg/mL) 取盐酸赛庚啶、盐酸可乐定、盐酸二苯拉林和盐酸可乐定-D4标准品各约10 mg， 精密称定，分别于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为1 mg/mL的盐酸赛庚啶、盐酸可乐定、盐酸二苯拉林和盐酸可乐定-D4标准贮备液。4℃下保存，有效期6个月。 1.4.2.2混合标准工作液((10ug/mL) 分别精密量取盐酸赛庚啶和盐酸可乐定标准贮备液各1mL， 于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为 10 ug/mL的盐酸赛庚啶和盐酸可乐定标准工作液。4℃下保存，有效期3个月。 1.4.2.3混合内标中间液 分别精密量取盐酸二苯拉林储备液100 uL、盐酸可乐定-D4储备液1mL，于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含盐酸二苯拉林 1 ug/mL 和盐酸可乐定 -D4 10 ug/mL 的混合内标中间液。于4℃下保存，有效期1个月。 1.4.2.4混合内标工作液 精密量取混合内标中间液1mL，于10mL量瓶中，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释至刻度，配制成含盐酸二苯拉林 100 ng/mL和盐酸可乐定-D41ug/mL的混合内标工作液，临用现配。 1.4.2.5标准曲线制备 精密量取混合标准工作液和混合内标工作液适量，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀释成赛庚啶和可乐定浓度为0.5、1、5、10、50和 100 pg/L系列混合标准工作液，其中含盐酸二苯拉林的浓度和盐酸可乐定-D4的浓度分别为 5 ug/L 和50 ug/L， 临用现配。 结果讨论 2.1标品质谱图与色谱图 对100 ug/L混标溶液进行分析，采用产物离子扫描模式确认赛啶啶、可乐定及其内标的碎片离子，如下图1所示。对空白溶剂和 0.5 ug/L混标溶液分析， MRM 色谱图如图2所示，色谱响应高，空白溶剂无干扰，赛庚啶和可乐定在4.5 min 内实现了良好分离。 图1 赛庚啶和可乐定及相应内标 MS2质谱图 图2：空白溶剂(a)、0.5ug/L混标 (b)色谱图(1、赛庚啶，2、、二苯拉林，3、可乐定，4、可乐定-D4) 2.2线性关系及检出限、定量限 对系列混合标准曲线溶液进行分析，以面积比为纵坐标，浓度比为横坐标，进行线性拟合。结果如表3所示，赛赛啶及可乐定在0.5-100 ug/L范围内，线性良好，线性相关系数均>0.995。以0.5 ug/L数据为依据，根据信信比 S/N=3、S/N=10计算检出限((LOD)、定量限(LOQ)，检出限和定量限均低于 0.5 ug/kg，完全满足标准要求。 赛庚啶 图3赛庚啶和可乐定标准曲线 表3 标准曲线、检出限及定量限 中文名称 线性方程 相关系数 准确度 检出限 定量限 (%) (ug/kg) (ug/kg) 赛庚啶 Y=(0.232364)X+(0.004906) 0.999 96.7-104.7 0.01 0.03 可乐定 Y=(0.760552)X+(0.00230698) 0.997 90.4-108.2 0.12 0.36 2.3重复性考察 对5 ug/L的标准溶液连续分析6次，计算保留时间和峰面积的RSD。结果见表4，赛庚啶、、可乐定的保留时间 RSD<0.2%，峰面积的 RSD<4.1%。仪器稳定性良好。 表4 保留时间和面积 RSD 序号 中文名称 保留时间 RSD(%) 面积RSD(%) 1 赛庚啶 0.08 0.81 2 二苯拉林(内标) 0.10 0.75 3 可乐定 0.19 4.05 4 可乐定-D4(内标) 0.12 1.17 2.4加标回收率考察 在空白猪肉样品上进行低、高水平(1ug/kg、10 ug/kg)的加标回收试验，个个浓度平行3次。结果见表5，赛庚啶及可乐定平均回收率在70.6~97.6%之间， RSD 均小于5.6%。 表5猪肉加标回收率结果 中文名称 低水平(1ug/kg) 高水平 (10pg/kg) 加标回收率/% 重复性/% 加标回收率/% 重复性/% 赛庚啶 70.9 1.7 70.6 4.3 可乐定 97.6 5.6 95.4 4.8 2.5实际样品测定 取2份猪肉样品，各平行制备两份，上机测定，两份样品均未检出赛庚啶和可乐定，如图4所示。 图4 猪肉样品色谱图 结论 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8045，参考《GB31660.7-2019猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定残留量的测定液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标标，建立了猪肉中赛庚啶和可乐定的测定方法。该方法可供相关行业参考。 岛津应用云 使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8045，建立了动物源性食品中赛庚啶和可乐定分析方法。参考《GB 31660.7—2019 猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，猪肉样品经酸性乙腈提取，氮吹浓缩，流动相初始比例溶液复溶，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。结果显示赛庚啶和可乐定线性良好，标准曲线相关系数均≥0.995，1 μg/kg、10 μg/kg浓度的加标回收率在70.6～97.6%之间，加标回收率相对标准偏差(RSD)<5.6%。该方法可满足猪肉样品中赛庚啶和可乐定的定性定量测定。