LC-MS/MS法分析肉类中美度铵残留

本实验使用岛津LCMS-8045液质联用系统，开发了肉中美度铵残留量的检测方法。实验结果表明，猪肉、虾基质效应分别为59%，27%，存在一定的基质抑制效应，因此采用基质匹配外标曲线定量。美度铵在猪肉、虾基质中0.5-100 ng/mL的范围内线性良好；精密度实验中，0.5 ng/mL美度铵保留时间RSD为0.14%，峰面积RSD为5.03%，仪器性能稳定；是猪肉、虾中美度铵的检出限在0.2、0.3 μg/kg，定量限在0.7、1.0 μg/kg，5、10、50 μg/kg加标回收率81.8%~109.5%之间，回收率良好。SSL-CA23-011Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-744 LC-MS/MS 法分析肉类中美度铵残留 LCMSMS-744 摘要：本文利用岛津三重四极杆液质联用仪，建立了肉类中美度铵残留量的测定方法。样品经碳酸氢铵-乙腈缓 冲液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。结果显示该方法在 0.5~100 ng/mL 浓度范围内建立校准 曲线，线性相关系数均大于 0.997，线性良好； 0.5 ng/mL 美度铵保留时间 RSD 为 0.14%，峰面积 RSD 为 5.03%；猪肉、虾中美度铵的检出限分别为0.2和0.3 ug/kg， 定量限分别为0.7和1.0 ug/kg， 5、10、50 ug/kg 加标回收 率在81.8%~109.5%之间。该方法分析速度快，灵敏度高，准确度好，适用于肉类产品中美度铵的残留量测定，也可为相关从业人员分析检测提供参考。 关键词：三重四极杆液质联用仪 美度铵 肉类 代谢调节剂 兴奋剂 技术特点： *提取液采用碳酸氢铵缓冲液，提取效率高，同时避免了溶剂效应的发生 。 美度铵 (Me l donium， Mildronate) ，又称米屈 阱 ，最初作为一种 生 长促进剂用于动物养殖，此外，作为左 旋肉碱抑 制 剂，在欧洲作为批准药物用治疗糖尿病、神 经退行性疾病和支气管肺疾病。就运动表现而言，对运 动员运动能力、耐力以及运动后恢复均有促进作用。因 止，2016年，世界反兴奋剂中 心 (WADA) 将美度铵列入 禁用清 S4.激素及代谢调节剂。国家体育总局也于2021年发布了《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》，要 求大型赛事举办方对肉食品中食源性兴奋剂 进 行检测， 其中美度铵参考检出限20 ug/kg。 目前，美度铵的检测方法包括液相色谱-串联质谱 法、液相色谱-高分辨质谱法，仅尿液、血液、干血斑 等基质有少量文献研究。但是食品基质的研究尚未见报 道。 本文采用液相色谱-串联质谱，建立了猪肉、虾中 美 度 铵残留 的 检测方法，对提取效率、基质效应等进行 了研究，并进行 了 详细的方法学考察。该方法快速、准确、灵敏度高，供相关行业参考。 实验部分 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为 输 液 泵 ： LC-40D XR×2 系 统 控 制 器 号：： CBM-40 自动进样器 SIL-40C XR 三重四极杆质谱仪：LCMS-8045 柱 温 品 箱 CTO-40C 色 谱 工作站 点： LabSolutions Ver. 5.113 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：Shim-pack Velox HIL I C (50 mm x2.1 mml.D.，2.7 um)，岛津((上海)实验器材有限公司， P/N：227-32025-02 流 动相 ：A相-10mM乙酸铵水溶液；B相-A：乙腈=5：95流速 束：0.3 mL/min 进样量：1uL 柱温 ：35°℃ 洗针液：水：乙腈((1：1) 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为80%，时间程序见表1。 表 1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 72 6.50 Pumps Pump B Conc. 50 7.50 Pumps Pump B Conc. 50 8.00 Pumps Pump B Conc. 80 11.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪：L LCMS-8045 脱溶剂管温度： 250℃ 离子源：ESH 雾 化气：多 氮气 3 L/min 加热模块温度：4400°℃接口温度：3300℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描 苗模 模 式： MRM 加热气：空气 10 L/min MRM 1参 数： 见表2 表2 MRM 参数 序号 中文名 英文名 前体离子(m/z) 产物离(m/z) CE(V) 1 58.25* -27.0 美度铵 Meldonium 147.20 59.25 -19.0 42.10 -55.0 *定量 离 子对 1.3样品前处理 准确称取样品1.0g， 置于50mL离心管中，准确加入50 mM 碳酸氢铵水：乙腈 青 (3：7)缓冲液10.0mL， 涡 旋 30s，超声提取 5 min， 17500 r/min 均质 30 s， 加入10 mL正己烷，轻轻混匀，4000 r/min 离心10 min， 弃 去正己烷层，吸取 2 mL 清液过HLB固相萃取柱，收集上样 液 ，过 0.22 um 尼龙滤膜，上机。 1.4标准溶液制备 基质标准系列工作液的配制：取空白样品，按照前处理净化，分别准确加入混合标准中间工作液适量，配制 成浓 度 为0.5、1、2、5、20、100 ng/mL 的标准工作曲线，待上机分析。 ■结果与讨论 2.1质谱条件优化 美度铵是β-氨基酸衍生物，属于两性化合物，季铵根离子在正离子模式下有很好的质谱响应，-20 eV和-55eV 叠加二级质谱图如下图1所示。 图1 美度铵 二 级质谱图 (CE 为-20eV和 -55eV 叠 加) 2.2色谱条件优化 美度铵极性很强， logp为-1.4，在反相C8、C18色谱柱上无保留。从结构上看，采用烷基磺酸根离子对试剂，可实现反相模式保留，但离子对试剂的引 入 ，会给质谱分析带来离子残留、竞争离子化等新的挑战。而采用亲 水作用色谱 (HILIC) 模式进行分析，，可实现质谱兼容的高灵敏度分析。本文对比了 Si l ica 、Diol、Amid e 等几种 常见的 HILIC 固定性的保留分离能力， Shim-pack Velox HILIC (50 mm x 2.1 mm l.D.， 2.7 um)、PC HILIC (150mm x2.0 mm 1.D.，3 um)、Shim-pack Diol HILIC (50 mm x2.1 mm 1.D.， 2.7 um)、Inersil HILIC (150mmx2.1mm l.D.， 3 um)、Inersil Amide (100 mmx2.1mm 1.D.，5 um)、Glycan BEH Amide (150 mmx2.1 mml.D.，1.7 um)。其中， Dio l 对于美度铵的保留较弱，难以分离基质中的干扰峰；两款 Amide 色谱柱对美度铵保留较 好，可以分离猪肉基质 中 的干扰峰，但是虾基质 中 干扰峰更多，即使是填料颗粒更小 的 Glycan BEH Amide 也 无法实现分离； Silica 固定相的色谱柱对美度铵 干 扰峰的保留分离效果更好；对于猪肉 、虾基质干扰均能实现 较好分离的是 Shim-pack Velox HILIC、PC HILIC 两款色谱柱， Shim-pack Velox HILIC 采用的是实心球颗粒的 高纯硅 胶 ，柱 效高，平衡快，更适合质谱匹配的快速分析。 流动相添加剂对色谱 峰 形，分离度有一定的影响，对比了水相加10 mM 乙酸铵、水相加0.1%甲 酸 、水相 加0.1%甲酸+10 mM 乙酸铵三种添加剂体系，添加甲酸导致色谱峰分叉，且分离度下降，无法将美度铵与基 质干扰峰分离，同时加甲酸对于质谱响应没有明显促进作用，因此，最 终选择 10 mM 乙酸铵作为流动相添加剂，结果见图2。 图22Velox HILIC 色谱图(猪肉 、虾基 质 ) 2.3前处理 考 察 美度铵分子量小，极性强，水溶性好，优先考虑使用含水比例高的提取试剂进行萃取，此外，肉类中蛋白 质脂肪含量 丰 富，特别是水溶性氨基酸对分离测定干 扰 较大，需 要一定的净化处理。本文对比了水/乙腈((1：9)、1%的甲酸水/乙腈(1：9)、0.1M磷酸缓冲液/乙腈(1：9)、0.1M EDTA-Mcllavine 水溶液 (pH=4.0、7.0、10.0)、50mM碳酸氢铵/乙腈(3：7)提取效率。20 ng/g 单点基质标测定提取效率，结果如下图所示，水/乙腈(1：9)提取效率54%，其他提取试剂均可以 80-105%的提取率。1%的甲酸水/乙 腈 (1：9)的提 取效率90%，但是样品溶液 pH 较低，，导致色谱分离度下降；0.1M磷酸缓冲液/乙腈(1：9)、0.1M EDTA-Mcllavine 水溶液在-pH=4.0、7.0、10.0均可以实现较好的提取效率，但含磷酸盐的缓冲液容易在质谱离子源 处形成结晶堵塞喷针，需要在净化过程中去除；50mM碳酸氢铵/乙腈(3：7) 可 以实现101%的提取效率，乙腈沉淀蛋白的同时，缓冲盐溶液可以让肉分散，让肉中的药物充分分散释放，水相比例不高于50%可以避免 溶剂效应，有利于 HILIC 模式分析 。因此最终选择了挥发性的碳酸氢铵缓冲溶液提取。 图3 不同 提 取剂的 提 取效率 根据提取的试剂不 同 ，采用两种类型的固相萃取净化方式： 1-0.1M EDTA-Mcllavine提取，净化时使用 styra MCX、SCX、WCX固相萃取柱；2-50mM碳酸氢铵/乙 腈 (3：7)提取， HLB固相萃取柱净化。pH=4.0的麦 氏溶剂提取后，仅 SCX 有一定的保留，当上样体积增大时，美度铵被洗脱。HLB净化时，无需活化，直接收集 上 样液，HLB对美度铵没有保留，可以实现对样品中弱极性至非极性组分净化。 2.4基质效应 基质中共流出组分影响离子化效率，对目标物测定产生 一 定影响，称为基质效应，基质效应(ME)=样品 提取后添加/纯的标准溶液，当ME>1时，表现为基质增强效应；当ME<1时，表现为基质抑制效应；且 当 ME 介于0.8~1.2之 间 时，通常认为不存在明显的基质增强或基质抑 制 效应，当超出此范围时表明存在较强基 质效应，须进行基质效应补偿。配制系列浓度的溶剂校准 曲 线和基质校准曲线，溶液校准曲线、猪肉基质曲线、虾基质曲线如图4所示，结果显示，猪肉基质效应在59%，虾基质效应在27%，均存在明显的基质抑制效应。为了平衡基质效应对定量准确性的影响，本文采用基质匹配外标曲线法定量。 图 4 猪肉、虾基质效应 2.5线性 按照1.4方法配制标准系列溶液，上机分析得出美度铵在猪肉、虾基质中线性范围和线性关系，。结果表明，美度铵在 0.5~100 ng/mL 范围内，线性良好，相关系数R均>0.997，准确度94.7%~107.7%之间。美度铵基 质校准曲线见图5。 表3 美度铵基质校准曲线的线性关系 化合物 基质 线性方程 相关系数 R 准确度(%) 美度铵 猪肉 Y=136318.3X+8170.1 0.9994 97.4~104.2 虾 Y=34568.9X+9147.8 0.9977 94.7~107.7 图5美度铵基质校准曲线 2.6精密度考察 取 0.5 ng/mL 的溶液标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，平行测定6次，计算保留时间 (R.T.)和峰面积 (Area ) 的 RSD%。结果显示美度铵的保留时间 (R.T.) 的 RSD 为 0.14%，峰 面积 (Area) 的 RSD 为 5.03%，实验结果表明仪器条件稳定性良好。 2.7检出限和定量限 取 0.5 ng/mL 的基质标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，根据信噪比，计算其检出限(S/N=3)和定量限 (S/N=10)。结果如表5显示，美 度 铵在猪肉、虾基质的检出限分别为0.2、0.3 ug/kg，定量限分别为0.7、1.0ug/kg。检出限、定量限满足《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》要求的 20 ug/kg。 2.8加标回收率 选择空白猪肉、虾，进行5、10、50 ug/kg 浓度的加标回收试验，每个加标浓度6个平行，按照前述前处 理方式处理，上机测定，以基质外标 曲 线法定量，计算回收率 。美度铵加标回收率在81.8%~109.5%之间，符 合指南要求。 表44美度铵加标回收率结果 基质 浓度 回收率(%) RSD(%) 猪肉 5 81.8 6 10 88.6 5 50 100.6 3 虾 5 88.9 15 10 90.9 15 50 109.5 12 ■结论 本实验使用岛津 LCMS-8045 液质联用系统，开发 了 肉中美度铵残留量的检测 方 法。实验结果表明，猪肉 、虾基质效应分别为59%，27%，存在一定的基质抑制效应，因此采用基质匹配外标曲线定量。美度铵在猪肉、虾基质中 0.5-100 ng/mL 的范围内线性良好；精密度实验中，0.5 ng/mL 美度铵保留时间 RSD 为 0.14%， 峰 面 积 RSD 为 5.03%，仪器性能稳定；是猪肉、虾中美 度 铵的检出限在0.2、0.3 ug/kg， 定量限在0.7、1.0 ug/kg， 5、10、50 ug/kg 加标回收率 81.8%~109.5%之间，回收率良好。 本文研究内容已正式发表，完整内容请参考文献 [1]郑锌，王 雨晴 ，李莹，李长坤，李月琪，黄涛宏 .亲水作用色谱-三重四极杆质谱法分析肉中代 谢 调节剂美 度铵残留 [J]. 环境化学，2022，41(4)：1457-1460. 岛津应用云