速溶咖啡中赭曲霉毒素A检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-032Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-449 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 测定速溶咖啡中赭曲霉毒素A 含量 LCMSMS-449 摘要：本文使用岛津LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪建立了一种 LC-MS/MS 测定咖啡中赭曲霉毒素A残留方法。样品经过超声提取、净化后进行液质联用分析，样品在2.5-100 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数>0.999，检出限在 0.48 ng/mL， 选2.5、5、10 ng/mL三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.069~0.448%和0.881~3.985%之间，系统精密度良好。同时考察了空白咖啡基质加标，回收率在85.9-97.5%之间，满足检测需求。 关键词：三重四极杆串联质谱 赭曲霉毒素A 速溶咖啡 赭曲霉毒素 (Ochratoxins)是一种有毒真菌代谢的产品，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物污染最普遍的是赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)。研究表明该种毒素可以损害动物的肾脏和肝脏，有致畸和致癌作用，因此被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。 咖啡作为一种饮品，深受大家喜欢，目前仅有少数国家制订了咖啡中赭曲霉毒素A的限量尺度。2017年，我国颁布了《食品中真菌毒素限量》国家标准GB 2761-2017，规定饮料类咖啡中赭曲霉毒素A的含量指标，其中研磨咖啡为 5 ug/kg， 速溶咖啡为 10 ug/kg。另外，《GB5009.96-2016食品中赭曲霉毒素A的测定》中也规定了 LC-MS/MS检测赭曲霉毒素的方法，但该方法中前处理操作较为繁琐。 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱 LCMS-8045 联用系统，建立了一种前处理简单的检测方法，可以快速准确测定咖啡中赭曲霉毒素A的方法。 实验部分 1.1仪器 岛津LCMS-8045 超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用系统，具体配置： LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC自动进样器， CTO-20A 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8045三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.96工作站软件。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (50 mm x2.1 mm l.D.， 2 um， Shimadzu SGLC P/N：227-30001-02) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液 B相-乙腈 流速：0.3mL/min 进样体积：2uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为50%，时间程序见表1。 表1时间程序 Time(min) Module Command Value 0.80 Pumps Pump B Conc. 50 2.00 Pumps Pump B Conc. 80 3.00 Pumps Pump B Conc. 80 3.01 Pumps Pump B Conc. 50 4.50 Controller Stop 质谱条件： 离子源 ：ESI(+) 脱溶剂管温度 ：250℃离子源接口电压：+4kV 加热模块温度 ：400°℃雾化气 ：氮气3.0L/min 接口温度 ：300℃干燥气 ： 氮气 10 L/min 扫描模式 ：MRM加热气 ： 空气10 L/min 驻留时间 ：100 ms碰撞气 ：氩气 MRM 参数 ：见表2 表2IMRM优化参数 中文名 英文名 监测离子对 Q1 Pre ((V) CE Q3 Pre (V) 赭曲霉毒素A Ochratoxins A 404.10>239.10* -28 -26 -22 (OTA) 404.10>358.10 -28 -13 -28 *表示定量离子 1.3标准品与试剂 标准品：购于上海安谱，于-20℃冰箱保存，备用。 试剂： HC-C18粉末 (QuEChERS 专用超洁净填料)，购于上海安谱。 乙腈：色谱级，室温保存。 实验用水：由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存。 样品前处理 2.1标准样品扫描质谱图 称取5.00g速溶咖啡粉末于离心管中，加入10 mL 0.1%甲酸酸化的乙腈，涡旋振荡5 min 至充分混匀，超声 5 min 后， 6000 r/min 离心5 min， 取上清液3mL加入装有100 mg C18粉末的离心管，涡旋振荡2min， 6000 r/min 离心5 min， 取上清液1mL， 40℃氮气吹至近干，初始比例流动相1mL复溶，过0.22um微孔滤膜后上机分析。 结果与讨论 3.1标准样品的 MRM 色谱图和线性范围 用空白基质溶液配制2.5、5、10、25、50、100 ng/mL 六个浓度的 OTA 标准溶液，按照1.2中的分析条件进行测定，采用外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，标准样品的 MRM 色谱图和校准曲线如图1所示。所得曲线线性关系良好，线性方程、线性范围、相关系数和检出限见表 3。 图1标准品的 MRM 色谱图(10ng/mL)和校准曲线 表3.校准曲线参数 中文名称 标准曲线 相关系数r 线性范围(ng/mL) 检出限(ng/mL) 赭曲霉毒素A Y=20710.0X+9377.72 0.9997 2.5-100 0.48 3.2精密度实验 不同浓度的混合标准工作液连续进样6次，用于考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.069~0.448%和0.881~3.985%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 RSD% (2.5 ng/mL) RSD% (10 ng/mL) RSD% (50ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 赭曲霉毒素A 0.448 3.985 0.099 1.088 0.069 0.881 3.3回收率实验 以空白咖啡样品进行加标回收实验，准确称取5g样品，分别添加低、中、高三个浓度水平的赭曲霉毒素A标准品，计算平均回收率。咖啡基质空白样品色谱图见图2，空白基质中不含赭曲霉毒素A。加标回收色谱图见图3，各添加水平的平均回收率在85.9-97.5%之间，详见表5。 图2咖啡空白基质色谱图 图3咖啡基质加标回收色谱图(20pg/kg) 表5赭曲霉毒素A回收率((n=3) 名称 加标水平(ug/kg) 回收率% RSD% 赭曲霉毒素A 10 85.9 1.461 20 90.0 2.741 100 97.5 1.026 结论 本文使用岛津LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪建立了一种 LC-MS/MS测定咖啡中赭曲霉毒素A残留的方法。样品经过超声提取、净化后进行液质联用分析，操作简便快捷，分析速度快。赭曲霉毒素A在2.5-100ng/mL范围内线性良好，线性相关系数>0.999，检出限在0.48 ng/mL， 选2.5、5、10 ng/mL三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.069~0.448%和0.881~3.985%之间，系统精密度良好。同时考察了空白咖啡基质加标，添加量为10、20、100 ug/kg三个浓度水水，回收率在85.9-97.5%之间，满足检测需求。 岛津应用云 赭曲霉毒素A在2.5-100 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数＞0.999，检出限在0.48 ng/mL，选2.5、5、10 ng/mL三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.069~0.448%和0.881~3.985%之间，系统精密度良好。同时考察了空白咖啡基质加标，回收率在85.9-97.5%之间，满足检测需求。