犬血浆中新剂型咖啡因片检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-029Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-448 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 使用 LCMS-8060 进行新剂型咖啡因片药代动力学研究 LCMSMS-448 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 进行了一种新剂型咖啡因片的临床前动力学研究。使用普萘洛尔作为内标进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法标准曲线相关系数大于0.997，方法准确度、重复性及残留比均可满足临床前研究需求。该方法操作简捷、特异性好、灵敏度高、分析速度快，可以为临床前咖啡因片药代动力学的研究提供借鉴和参考。 关键词： LCMS-8060 咖啡因片药代动力学 咖啡因属于中枢系统兴奋药，具有抗疲劳作用，在我国属于精神二类药品，在美国属于 OTC 药物。.目前，美国已上市常见咖啡因片尚未进口国内，国内也无同类药品上市。本项目中的新剂型咖啡因片已获得NMPA 相关立项许可，目前进入处方验证阶段。本研 究使用岛津液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8060，建立了比格犬血浆中咖啡因的含量测定方法，并利用该方法，表征不同处方制剂的咖啡因片在比格犬体本的药物释放、吸收处置等动力学特征，以筛选优化制剂处方。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵，DGU-20A， 在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.93 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：Kromasil 100-5 C18，50×2.1 mm， 5 um 流动相：A相-0.1%甲酸水；B相-甲醇 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 泵 B.Conc 5 2.50 泵 B.Conc 95 3.00 泵 B.Conc 95 3.10 泵 B.Conc 5 5.00 控制器 Stop 质谱条件： 分析仪器 ：LCMS-8060 离子源 ：ESI(+) 雾化气流速 ： 3.0L/min 加热气流速 ： 10.0 L/min 接口温度 ：300°℃ DL温度：250°℃加热模块温度：400℃干燥气流速：10.0 L/min扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：见表2 表2MRM参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 PreBias (V) CE(V) Q1 PreBias (V) 咖啡因 195.1 138.3* 11 -15 16 110.2 12 -19 11 *表示定量离子 1.3标准溶液配制及样品处理 咖啡因标准储备液制备：精确称取咖啡因20.0mg，加1mL水涡旋溶解，得到浓度为20 mg/mL标准储备液。内标溶液配制：使用甲醇配制浓度为 50 ng/mL 的普萘洛尔备用。 溶液标曲配制：取上述储备液以甲醇逐级稀释，制备系列标准溶液，浓度分别为 0.2 ug/mL、0.5 ug/mL、2 ug/mL、5 ug/mL、20 ug/mL、50ug/mL。同法配制浓度分别为1 ug/mL、10 ug/mL、40 ug/mL的QC溶液。 样品前处理：取空白比格犬血浆5uL，分别加入5 uL不同浓度的溶液标曲和QC溶液制作基质标曲和QC。待测样品取血浆5uL，加入5uL空白甲醇混匀。所有样品分别加入100 uL的50ng/mL普萘洛尔内标溶液，涡旋振荡后，14000 rpm 离心10 min， 取 10 uL 上清加 90 uL甲醇，混匀，置于进样瓶中上机分析。 结果与讨论 2.1标准样品扫描质谱图 图1咖啡因的二级质谱扫描特征图谱 2.2线性测定结果 按照上述1.3中方式进行基质标曲配制及前处理，以血浆样品中咖啡因的检出峰面积与理论浓度进行线性拟合，药物在比格犬血浆中的线性范围为 0.2-50 ug/mL， 经检测，标准曲线相关系数为0.997，符合定量要求，标准曲线及统计结果如下所示： Conc.Ratio (ppm) 图2基质标曲图 表3标准曲线结果 编号 目标物 线性方程 线性范围(ug/mL) 相关系数 准确度(%) 1 咖啡因 Y=(2.14431)X+(0.176112) 0.2~50 0.997 88.4~107.5 2.3重复性测定结果 按1.3中的前处理方法对空白血浆添加低中高浓度标准品作为低中高浓度质控品，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，每个样品平行平备6份，保留时间的 RSD% 在0.09%-0.13%之间，咖啡因与内标峰面积比的 RSD%在1.93%~2.54%之间，满足测定需求。 表4重复性考察结果(n=6) 名称 LQC(1pg/mL) 1 RSD(%) MQC (10 ug/mL) RSD(%) HQC (40 ug/mL) RSD(%) 保留时间 面积比 保留时间 面积比 保留时间 面积比 咖啡因 0.12 2.54 0.13 1.93 0.09 2.15 2.4残留考察 根据药品非临床药代动力学研究指导规则要求， 在50 ug/mL的样品分析完成后对空白样品进行分析考察残留对样品测定的影响。按照上述方法，样品经色谱分离后，比格犬血浆中咖啡因的保留时间约为2.35 min， 内标普萘洛尔的保留时间约为2.67 min。残留考察空白血浆及实际样品色谱图见下图3与图4，残留考察结果如表5所示。残留面积和定量下限0.2 ug/mL 的面积比为8.6%，小于药品非临床药代动力学研究指导规则不得过 20%的要求。 图33比格犬残留考察空白血浆色谱图 RT (min) 图4 比格犬血浆样品色谱图 表55残留考察结果 样品名称 咖啡因面积 内标面积 空白 15299 559 定量下限 176902 293417 残留比% 8.6 0.2 2.5比格犬口服药物后体内药物动力学结果 比格犬口服咖啡因片参比制剂与两种受试制剂后，采集采的血浆样品按1.3进行前处理，并使用LCMS-8060对样本进行分析。经WinNolin Ver.6.3软件对所测数据进行处理得到药代动力学主要参数见表6，药-时曲线见图5。综合图、表中数据分析可得，在相同剂量下，受试制剂与参比制剂在比格犬体内的的代动力学过程基本一致。 表6比格犬咖啡因灌胃给药后的主要药代动力学参数(n=6) Parameters 药代动力学参数( (Mean±SD) 参比制剂 受试制剂-1 受试制剂-2 t1/2(h) 5.87±0.53 5.02±0.55 4.49±1.10 Tmax (h) 1.50±1.15 1.17±0.45 0.79±0.37 Cmax (ug/mL) 39.53±4.81 27.71±5.82 41.88±10.05 Cmax_D(ug*kg/mL/mg) 1.61±0.19 1.48±0.11 1.74±0.14 AUC(0-t) (h*ug/mL) 329.91±64.58 190.94±29.93 312.98±63.76 AUC(0t)_D (h*ug*kg/mL/mg) 13.35±2.05 10.82±3.25 13.48±3.92 AUC(0-o) (h*ug/mL) 333.97±67.43 191.44±29.80 319.01±64.75 AUC(0-oo)_D_obs (h*ug*kg/mL/mg) 13.50±2.10 10.85±3.26 13.73±3.89 MRT(0-c) (h) 8.03±1.69 7.62±1.74 6.62±1.56 MRT(o-t) (h) 8.51±2.42 7.76±1.69 7.10±1.63 图5比格犬灌胃给药后咖啡因参比制剂和受试制剂的药-时曲线 结论 使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 进行了一种新剂型咖啡因片的临床前动力学研究。使用普萘洛尔作为内标进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法标准曲线相关系数大于0.997，方法准确度、重复性及残留比均可满足临床前研究需求。使用该方法对新剂型咖啡因片进行了临床前动力学研究，结果表明受试制剂与参比制剂在比格犬体内的药代动力学过程基本一致。 岛津应用云 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8060进行了一种新剂型咖啡因片的临床前动力学研究。使用普萘洛尔作为内标进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法标准曲线相关系数大于0.997，方法准确度、重复性及残留比均可满足临床前研究需求。使用该方法对新剂型咖啡因片进行了临床前动力学研究，结果表明受试制剂与参比制剂在比格犬体内的药代动力学过程基本一致。