血清中抗病毒药物检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-039Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-450 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050测定人血清中6种抗病毒药物 LCMSMS-450 摘要：使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用建立了人血清中洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔及奥司他韦6种抗病毒药物同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足日常检验需求。该方法可以为人血清中抗病毒药物的检测提供很好的借鉴和参考。 关键词： LCMS-8050抗病毒药物 血清 新型冠状病毒肺炎 新型冠状病毒肺炎爆发后，国家卫健委发布1号公告，将新型冠状病毒感染的肺炎纳入传染病防治法规定的乙类传染病，但采取甲类传染病的预防、控制措施，同时将其纳入检疫传染病管理。国家卫生健康委员会及国家中医药管理局先后发布更新了七个版本《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》。第六版及第七版诊疗方案均提出，使用洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔等抗病毒药物治疗新型冠状病毒肺炎。诊疗方案同时提出，要注意上述药物的不良反应及禁忌症(如患有心脏疾病者禁用氯喹)以及其他药物的相互作用问题，在临床应用中进一步评价目前 所试用药物的疗效。同时，由中国药师协会治疗药物监测药师分会及众多权威组织编撰《新型冠状病毒肺炎及常见合并症药物治疗与药学监护指引》，该指引明确指出加强对上述抗病毒药物进行药学监护。 本文使用岛津液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050，建立了人血清中洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔及奥司他韦6种抗病毒药物含量测定方法(6种抗病毒药物结构信息见图1)，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，线性范围宽，专属性强，供相关人员参考。 图16种抗病毒药结构信息 |实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8050。具体配置为 LC-30AD×2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30ACMP(自动进样器)， CTO-30A(柱温箱)，CBM-20A系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： InertSustainBio C18 HP (100 mm×2.1 mm I.D.， 3 um) 流动相：流动相A-0.05%甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)；流动相B-乙腈 流速：0.4 mL/min 柱温：40℃ 进样量：0.5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表1。 表12梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 20 1.50 Pumps Pump B Conc. 95 2.50 Pumps Pump B Conc. 95 2.60 Pumps PumpB Conc. 30 3.50 Pumps Pump B Conc. 30 4.50 Pumps Pump B Conc. 95 5.50 Pumps Pump B Conc. 95 5.60 Pumps Pump B Conc. 20 7.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8050 加热模块温度：400℃ 离子源：ESI(+) DL温度：250℃ 雾化气流速：3.0L/min 离子源温度：300℃ 加热气流速：10.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0L/min MRM参数：见表2 表2MRM 参数 名称 英文名称 前体离子 产物离子 Q1Pre Bias (V) CE(V) Q3Pre Bias (V) 洛匹那韦 Lopinavir 629.4 155.2* -24 -12 -30 629.4 447.4 -24 -30 -22 利托那韦 Ritonavir 721.4 296.15 -22 -10 -14 721.4 268.15 -22 -12 -18 利巴韦林 Ribavirin 245.2 113.2* -13 -10 -23 245.2 96.2 -21 -30 -19 磷酸氯喹 Chloroquine 320.3 247.15* -17 -35 -25 diphosphate 320.3 142.2 -13 -30 -14 阿比多尔 Arbidol 477.1 432.0* -19 -30 -30 477.1 279.0 -19 -25 -29 洛匹那韦-D Lopinavir-D8 637.4 163.25 -26 -46 -30 利托那韦-13C，D Ritonavir-13C，D3 725.3 300.1 -28 -19 -20 注：*为定量离子对 1.3标准品及样品制备 标准工作曲线配制：取6种抗病毒药母液，用乙腈逐步稀释成系列浓度的标准工作液，取90 uL空白血清，加入10 uL标准工作液，混匀，配制成标准工作曲线，具体浓度见表3。内标母液使用乙腈稀释成含2000ng/mL 洛匹那韦-Dg及 800 ng/mL 利托那韦 -13C，D3混合内标工作液。 表337标准曲线浓度信息 (ng/mL) 名称 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 洛匹那韦 20 100 200 500 2000 5000 20000 利托那韦 5 25 50 125 500 1250 5000 利巴韦林 10 50 100 250 1000 2500 10000 磷酸氯喹 10 50 100 250 1000 2500 10000 阿比多尔 5 25 50 125 500 1250 5000 奥司他韦 2 10 20 50 200 500 2000 标准品及血清样品前处理方法：取100uL标准工作曲线或血清样本，加入10uL内标工作液及290 uL乙腈，涡旋均匀，13000 rpm 离心5 min， 取 300 uL上清液，进样分析。 结果与讨论 2.1 MRM 色谱图 图2标准曲线最低点谱图 2.2线性关系 采用内标法建立洛匹那韦、利托那韦2种抗病毒药物标准曲线，采用外标法建立利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔、奥司他韦4种抗病毒药物标准曲线，结果如表4所示。结果显示，6种抗病毒类药物在线性浓度范围内线性相关性良好，相关系数均在0.994以上，准确度均在85%~115%之间。 表4标准曲线结果 目标物 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 洛匹那韦 Y=(0.0129538)X+(-0.00141657) 20~20000 0.9977 90.1~109.8 利托那韦 Y=(0.000372660)X+(-5.46889e-005) 5~5000 0.9977 90.0~110.3 利巴韦林 Y=(243.414)X+ (639.173) 10~10000 0.9973 91.1~110.1 磷酸氯喹 Y=(1573.42)X+(-145.614) 10~10000 0.9964 92.4~113.3 阿比多尔 Y=(1758.43)X+(-651.971) 5~5000 0.9954 91.1~111.1 奥司他韦 Y=(5082.96)X+(5033.83) 2~2000 0.9948 92.8~112.6 2.3质控样本准确度考察 按1.3中的前处理方法对空白血清添加低中高浓度质控品，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，质控品的准确度结果如表5所示，结果显示质控品测定结果与理论值接近，满足日常测定需求。 表5质控准确度考察结果 目标物 LQC理论值 LQC回收率 MQC 理论值 MQC 回收率 HQC理论值 HQC 回收率 (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) (ng/mL) (%) 洛匹那韦 50 106.3 1000 103.1 10000 109.8 利托那韦 12.5 105.4 250 97.2 2500 110.3 利巴韦林 25 93.6 500 99.9 5000 107.7 磷酸氯喹 25 86.1 500 99.7 5000 114.6 阿比多尔 12.5 85.2 250 100.8 2500 113.0 奥司他韦 5.0 112.2 100 95.5 1000 99.0 2.4精密度考察 ( 按1.3的前处理方法和1.2中分分析条件对低浓度质控品连续6针分析，重复性结果显示，峰面积精密度RSD 分别为 1.8%、 1 .9%、2.4%、2.2%、11.7%及1.9%，表明仪器稳定性良好。 ) 图3低浓度质控连续6针分析稳定性谱图 结论 使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用建立了人血清中洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔及奥司他韦6种抗病毒药物同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足日常检验需求。该方法可以为人血清中抗病毒药物的检测提供很好的借鉴和参考。 岛津应用云 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用建立了人血清中洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔及奥司他韦6种抗病毒药物同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足日常检验需求。该方法可以为人血清中抗病毒药物的检测提供很好的借鉴和参考。