血清中26种抗癫痫药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-064Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-457 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 利用 LCMS-8050 CL 定量分析血清中26种抗癫痫药物 LCMSMS-457 摘要：本文使用岛津临床质谱仪 LCMS-8050 CL，结合德国 Recipe 公司的抗癫痫药物试剂盒，利用蛋白沉淀的前处理方法，建立了血清中26种抗癫痫药物浓度监测的定量分析方法。采用内标法建立标准曲线，26种抗癫痫药线性相关性良好，相关系数均在0.9992以上，准确度在94.2~105.9%之间。试剂盒中LQC 和 HQC两个质控连续6针进样的峰面积比 RSD 小于5.44%，准确度在88.6~113.2%之间。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，可为临床抗癫痫药物浓度监测提供参考。 关键词：LCMS-8050 CL抗癫痫血清 治疗药物浓度监测 治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)是临床药理学的重要研究内容之一，主要通过采用灵敏的现代分析测试手段来定量分析患者血液样本中的药物及其代谢产物的浓度，探讨血药浓度与药物疗效、毒性之间的关系，以确定药物有效浓度及毒性浓度之间的范围，并可根据药物动力学公式来计算最佳的治疗剂量，做到用药个体化，指导临床合理用药。 癫痫是一种具有持续性产生痫性发作倾向的脑部疾患；特点是持续存在能产生痫性发作的易感性，并出现相应的神经生物学、认知、心理学和社会功能等方面的后果。目前市场上治疗癫痫的药物种类繁多，2015年抗癫痫药销售份额前十的产品占整个市场份额的99%。排名前三的分别是丙戊酸钠、左乙拉西坦和 奥卡西平。不同的癫痫病患者对各种抗癫痫药物的敏感度不同，个体差异较大，为了实现最佳治疗效果，需要对服药患者体内的药物浓度进行监测。 目前用于抗癫痫药物浓度监测的方法有免疫检测法、原子吸收法、色谱法，为了提高检测的准确度和灵敏度，越来越多的医院和第三方医学检测中心逐步开发出用于抗癫痫药物浓度监测的液相色谱串联质谱法。 本文基于抗癫痫药物商品化试剂盒，利用岛津LCMS-8050 CL 开发了定量分析血清中抗癫痫药物的方法。该方法方便、快捷，实现了26种抗癫痫药物的同时快速分析，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津临床质谱仪LCMS-8050 CL(国械注进20182400195))c 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Volex PFPP (50 mm x 2.1 mml.D.， 2.7 um)； P/N：227-32021-02 流动相：A相-5mM甲酸铵水溶液；B相-甲醇/乙腈=1/1 流速：0.6mL/min 柱温：40℃ 进样量：0.5uL 自动进样器温度：10℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.5 Pump B.Conc 5 Pump B.Conc 16 1.5 Pump B.Conc 16 2.5 Pump B.Conc 40 3 Pumc B.Conc 40 3.5 Pump B.Conc 85 3.8 Pump B.Conc 85 3.81 Pump B.Conc 5 4.5 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI+/- 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 干燥气流速：10.0L/min 加热热流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：300℃ 驻留时间： 5 ms DL 温度：250℃ MRM 参数：见表2 1.3试剂盒信息 品牌：德国Recipe 组成：血清基质标品、血清基质质控、内标、蛋白沉淀剂 表2 抗癫痫药物及其内标 MRM 参数 CAS号 中文名 英文名 前体离子 产物离子 CE m/z m/z (v) 29331-92-8 利卡西平 10，11-Dihydro-10-OH- 255.0 194.1 -25 Carbamazepine 165.1 -25 298-46-4 卡马西平 Carbamazepine 237.1 194.1 -39 165.1 -39 104839-39-6 10-羟基-奥卡西平 Carbamazepine-Diol 271.3 180.1 -25 210.1 -25 36507-30-9 卡马西平10，11-环氧化物 Carbamazepine- 253.1 180.1 -25 Epoxide 210.1 -25 25451-15-4 非氨酯 Felbamate 239.1 117.1 -21 65.1 -55 60142-96-3 加巴喷丁J Gabapentine 172.1 137.1 -20 55.1 175481-36-4 拉科酰胺 Lacosamide 251.1 91.1 74.1 84057-84-1 拉莫三嗪 Lamotrigine 256 58.1 -35 43.2 -35 d4-普瑞巴林 d4-Pregabaline 164 146.2 -16 LCMSMS-457 d5-扑米酮 d5-Primidone 224.3 167.1 -13 d4-瑞替加滨 d4-Retigabine 308.2 113 -36 d9-斯利潘托 d9-Stiripentol 226 196.2 -13 d6-噻加宾 d6-Tiagabine 382.1 253.1 -21 d3-乙琥安 d3-Ethosuximide 143.2 42.1 24 d5-苯巴比妥 d5-Phenobarbital 236.1 42 16 d12-托吡酯 d12-Topiramate 350.3 78 27 d6-丙戊酸 d6-Valproic acid 149.2 149.2 0 15N，d4-唑尼沙胺 15N，d4-Zonisamide 216.2 123.1 14 标准品、质控品和样品前处理 精密吸取标准品(或质控品或样品)50 uL， 加入100 uL 含有内标的蛋白沉淀剂，涡旋混匀30s， 10000g离心5分钟，吸取上清液待分析。 结果与讨论 3.1抗癫痫药物色谱图 图1 抗癫痫药物色谱图(标曲中间点L2) 表3血清基质标曲和质控浓度 目标物 血清基质标曲浓度 (ng/mL) 血清基质质控 (ng/mL) L1 L2 L3 LQC HQC 10，11-Dihydro-10-0H-Carbamazepine 2.8 14.1 42.9 7.68 19.4 Carbamazepine 1.44 7.39 20.6 4.06 9.24 Carbamazepine-Diol 0.542 2.78 8.74 1.62 3.85 Carbamazepine-Epoxide 0.625 3.23 9.57 1.66 3.94 Felbamate 7.04 34.8 106 18.8 45.4 Gabapentine 1.87 8.63 27.8 4.65 11 Lacosamide 0.879 4.52 13.9 2.43 5.66 Lamotrigine 1.55 7.86 23.1 4.17 9.86 Levetiracetam 4.32 21.6 67.3 11.9 29.1 Oxcarbazepine 0.249 1.3 3.99 0.76 1.88 Phenylethylmalonamide 0.711 3.75 11.5 2.11 5.03 Perampanel 0.0974 0.485 1.46 0.281 0.633 Phenytoin 1.94 9.43 28.3 4.91 11.2 Pregabaline 0.565 3 9.56 1.51 4.02 Primidone 1.63 9.12 28.8 4.67 11.3 Retigabine 0.134 0.727 2.3 0.388 0.961 Rufinamide 3.11 15.5 47.4 8.93 20.8 Stiripentol 1.24 5.86 17.8 3.32 7.83 Tiagabine 0.0204 0.103 0.316 0.0602 0.14 Ethosuximide 8.33 39.4 119 21.2 50.7 N-Desmethylmethsuximide 3.44 15.9 50.9 9.07 21.2 Phenobarbital 3.54 16.3 51.3 9.65 22.7 Sulthiame 0.946 4.5 12.7 2.43 5.74 Topiramate 1.23 5.85 17.7 3.26 7.74 Valproic acid 8.59 37.9 114 22.6 52.9 Zonisamide 3.05 14.2 42.5 8.29 19.8 3.2抗癫痫药物血清基质标曲相关信息 采用内标法建立标准曲线，结果如表4所示。结果显示，26种抗癫痫药在线性浓度范围内线性相关性良好，相关系数均在 0.9992以上，准确度在 94.2~105.9%之间(表4)。 表4 抗癫痫药物血清基质标准曲线相关参数t(采用1/C 加权) 目标物 校准曲线 相关系数R 准确度% 10，11-Dihydro-10-0H-Carbamazepine Y=(1.25559)X+(0.0323192) 0.9997 96.3~102.6 Carbamazepine Y=(0.617675)X+(-0.0648802) 0.9997 96.6~102.4 Carbamazepine-Diol Y=(0.898148)X+(-0.0221804) 0.9995 95.3~103.4 Carbamazepine-Epoxide Y= (3.08943)X+(-0.179619) 0.9996 96.0~102.8 Felbamate Y=(0.107331)X+(-0.0361019) 0.9998 97.9~102.9 Gabapentine Y=(0.107685)X+(-0.0304816) 0.9999 98.8~100.9 Lacosamide Y=(0.249149)X+(0.00698630) 0.9999 98.8~100.9 Lamotrigine Y=(0.149038)X+(0.0263362) 0.9993 94.8~103.7 Levetiracetam Y=(0.0143571)X+(-0.00276382) 0.9997 97.2~103.9 Oxcarbazepine Y=(0.315198)X+(0.0119151) 0.9999 99.1~101.2 Phenylethylmalonamide Y=(0.315173)X+ (0.0496432) 0.9999 98.8~101.7 Perampanel Y=(21.6916)X+(0.352736) 0.9994 96.3~105.1 Phenytoin Y=(0.0412568)X+(0.0104746) 0.9992 94.2~104.1 Pregabaline Y=(0.161023)X+(0.0238825) 0.9997 97.3~103.7 Primidone Y=(0.0355124)X+(0.0192058) 0.9999 99.0~101.4 Retigabine Y=(0.168644)X+(-0.00256282) 0.9999 99.7~100.3 Rufinamide Y=(3.60201)X+(-0.919409) 0.9999 98.1~101.4 Stiripentol Y=(0.390582)X+(0.00634797) 0.9995 96.9~104.3 Tiagabine Y=(3.68760)X+(0.00610601) 0.9999 97.6~101.7 Ethosuximide Y=(0.0665237)X+(-0.0281573) 0.9999 99.7~100.4 N-Desmethylmethsuximide Y=(0.0134140)X+(0.00210189) 0.9992 95.6~105.9 Phenobarbital Y=(0.0456657)X+(-0.0312873) 0.9992 95.8~105.7 Sulthiame Y=(0.654952)X+(0.0359962) 0.9992 96.1~105.6 Topiramate Y=(0.546572)X+(0.00174642) 0.9995 95.5~103.2 Valproicacid Y=(0.449515)X+(-0.360189) 0.9999 98.4~102.2 Zonisamide Y=(0.268857)X+(-0.00497531) 0.9997 97.5~103.5 3.3精密度和准确度测定 利用试剂盒中 LQC 和HQC 两个质控进行精密度测定(连续6针进样)， LQC和HQC两个质控点各个化合物的浓度如表3所示，数据统计分析得到精密度和准确度测定结果如表5所示。连续6针进样的峰面积比RSD 小于 5.44%，准确度在88.6~113.2%之间(表5)。 表5 抗癫痫药物质控 LQC 和 HQC精密度和准确度测定结果 目标物 峰面积比 RSD% 准确度% LQC HQC LQC HQC 10，11-Dihydro-10-0H-Carbamazepine 3.87 4.00 96.9~104.7 93.0~100.5 Carbamazepine 1.89 4.83 96.7~100.2 94.5~103.9 Carbamazepine-Diol 3.77 5.44 92.5~99.3 95.9~106.4 Carbamazepine-Epoxide 0.76 4.05 102.5~104.0 98.5~106.6 Felbamate 2.16 2.30 97.2~101.2 92.2~96.1 Gabapentine 4.59 4.49 104.3~113.2 99.3~108.6 Lacosamide 0.85 1.85 107.8~109.5 104.3~108.2 Lamotrigine 1.54 1.36 109.4~112.8 108.4~111.2 Levetiracetam 3.77 2.11 104.1~111.7 96.2~100.1 Oxcarbazepine 2.06 4.57 104.2~108.8 95.6~104.9 Phenylethylmalonamide 1.08 3.53 107.7~110.0 109.0~114.2 Perampanel 4.28 4.48 102.8~109.6 99.4~110.5 Phenytoin 1.34 3.40 103.3~105.9 100.0~106.4 Pregabaline 2.55 0.94 101.8~107.5 95.8~97.6 Primidone 5.52 5.08 98.4~109.9 100.8~112.1 Retigabine 3.88 2.29 97.8~107.9 102.8~111.3 Rufinamide 1.39 4.26 107.9~110.8 94.6~102.5 Stiripentol 4.39 5.54 105.4~107.4 96.2~107.2 Tiagabine 2.74 3.99 95.5~100.9 95.9~103.9 Ethosuximide 2.98 1.10 86.3~91.3 90.5~92.5 N-Desmethylmethsuximide 1.68 2.05 107.6~111.0 106.0~110.2 Phenobarbital 3.76 1.50 94.1~100.9 88.6~91.2 Sulthiame 0.61 3.55 105.6~111.2 97.3~104.6 Topiramate 5.07 4.76 98.1~105.9 92.4~100.9 Valproic acid 3.72 3.38 97.1~104.3 87.6~93.3 Zonisamide 2.28 1.87 98.5~102.6 92.7~95.9 3.4 实际样本测定结果 利用以上方法对10个临床癫痫病服药患者血清样本 (S1~S10)进行定量分析，结果如下表表示。 表6 临床患者样本检测结果 目标物 样品浓度 ((ng/mL) S2 S1 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 10，11-Dihydro-10-0H- Carbamazepine 25.97 Carbamazepine 6.35 6.49 5.55 Carbamazepine-Diol 1.34 2.05 0.93 1.72 Carbamazepine-Epoxide 1.41 2.17 0.77 2.54 Felbamate Gabapentine Lacosamide Lamotrigine 3.72 4.88 2.54 Levetiracetam 17.45 16.23 9.38 7.25 7.89 5.62 1.21 Oxcarbazepine 5.28 Phenylethylmalonamide Perampanel Phenytoin Pregabaline Primidone Retigabine Rufinamide Stiripentol Tiagabine Ethosuximide N-Desmethylmethsuximide Phenobarbital 注：-代表未检出 结论 本文使用岛津临床质谱仪LCMS-8050 CL， 结合德国 Recipe 公司的抗癫痫药物试剂盒，利用蛋白沉淀的前处理方法，建立了血清中26种抗癫痫药物浓度监测的定量分析方法。采用内标法建立标准曲线，26种抗癫痫药线性相关性良好，相关系数均在0.9992以上，准确度在 94.2~105.9%之间。试剂盒中 LQC 和 HQC两个质控连续6针进样的峰面积比 RSD 小于5.44%，准确度在88.6~113.2%之间。该方法分析速度快、稳定性和准确度好， 可为临床抗癫痫药物浓度监测提供参考。 岛津应用云 本文使用岛津临床质谱仪LCMS-8050 CL，结合德国Recipe公司的抗癫痫药物试剂盒，利用蛋白沉淀的前处理方法，建立了血清中26种抗癫痫药物浓度监测的定量分析方法。采用内标法建立标准曲线，26种抗癫痫药线性相关性良好，相关系数均在0.9992以上，准确度在94.2~105.9%之间。试剂盒中LQC和HQC两个质控连续6针进样的峰面积比RSD小于5.44%，准确度在88.6~113.2%之间。该方法分析速度快、稳定性和准确度好，可为临床抗癫痫药物浓度监测提供参考。