沙坦类药物中6种N-亚硝胺含量检测方案(气质联用仪)

SSL-CA20-070Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-193 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn GC-MS/MS 法测定沙坦类药物中6种N-亚硝胺含量 GCMSMS-193 摘要：本文建立了三重四极杆气质联用仪测定沙坦类药物中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质含量的方法。结果表明：在1~50 ng/mL的浓度范围内，6种N-亚硝胺的线性相关系数r为0.999以上，线性关系良好。将对照品溶液重复进样6次，峰面积 RSD%小于10%，定量离子信噪比大于30，定性离子信噪比10，满足欧洲药典质量控制要求。实际样品在30 ng/g 的加标水平下，加标回收率为 90%~105%。本方法参考欧洲药典GC-MS/MS 法检测沙坦类药中6种N-亚硝胺相关标准，可为沙坦类药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定提供参考。 关键词：三重四极杆气质联用仪N-亚硝胺 沙坦类药物基因毒性杂质 N-亚硝胺，是遗传毒性杂质的一种，属于2A类 亚硝胺，之后使用 GC-MS/MS法检测5种亚硝胺，岛致癌物。 津公司均及时发布了相应解决方案。 N-亚硝胺是一种常见的污染物，在水和食品中，包括熏肉和烤肉、奶制品中均有发现。最早在药品中被发现是2018年7月，EMA发布公告称其在抗压药结沙坦中检出NDMA，引起社会的广泛关注，并给相关企业造成巨大损失。FDA、中国药典接连发布了相关检测标准，从最早采用顶空 +GCMS法检测2种N- 2020年4月欧洲药典发布了三种不同仪器检测沙坦类药物中N-亚硝胺的征求意见稿。本文参考该征求意见稿，开发了 GC-MS/MS 法测定沙坦类药物中6种N-亚硝胺检测方法，使用本征求意见稿方法，前处理净化效果好，可检测的N-亚硝胺种类更多。 实验部分 1.1仪器 三重四极杆气相色谱-质谱联用仪： GCMS-TQ 8050 NX 1.2分析条件 色谱柱： Rtx 624SilMS， (60m×0.32 mm 进样方式：不分流进样 ×1.8um 离子源温度：230℃ 柱温程序：40℃(1min)_40℃/min_180C 接口温度：300℃ _20℃/min_300℃ (2 min) 检测器电压：调谐电压+0.6kV 进样量：2uL 采集方式：MRM(采集参数见表1) 载气控制方式：恒线速度(36.1cm/sec) 1.3样品前处理 准确称取 250 mg沙坦类药物至50mL离心管中，加入10 mL氢氧化钠溶液(称取4gNaOH， 超纯水溶解，加入5mL乙乙，并用超纯水定容至100mL)， 振摇5 min， 准确加入含内标 NEMA 的二氯甲烷溶液友(内标含量为 10 ng/mL) 2mL， 振摇 5 min 后，4000 r/min 离心 5min， 取下层有机层用 GC-MS/MS分析。 结果讨论 2.1对照品溶液 MRM 图谱 准确称取样品250mg， 添加混标，加标浓度为30 ng/g(欧洲药典定量限)，按照1.3的方法进行样品前处理，得到的溶液作为对照品溶液 (Reference Solution)，上机浓度为3.75 ng/mL， 其MRM 图见图1， MRM 采集参数见表1。 图1 6种N-亚硝胺 MRM图(浓度为3.75 ng/mL) 表1 6种N-亚硝胺及内标 MRM 参数信息 No. 组分名称 保留时间 定量离子对 碰撞电压 CE 定性离子对 碰撞电压 CE (min) (m/z) (m/z) NDMA 6.455 74.00>44.10 6 74.00>42.10 24 NEMA(内标) 7.000 88.00>71.10 88.00>43.10 9 3 NDEA 7.460 102.00>85.10 10 102.00>56.10 18 4 NEIPA 7.885 116.00>99.10 116.00>44.00 15 5 NDIPA 8.270 130.00>42.10 C 130.00>113.00 3 6 NDPA 8.610 130.00>113.10 130.00>43.10 15 7 NDBA 9.905 158.00>99.00 158.00>141.20 6 2.2标准曲线与检出限 按照对照品配制方法配制标准溶液，浓度分别为1、2.5、5、10、20、50 ng/mL，内标浓度为10 ng/mL。以目标组分与内标浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐坐，绘制标准曲线，见图2。线性相关系数见表2，以1ng/mL浓度标准溶液的3倍信噪比计算检出限，见表2。 Area Ratio Area Ratio -NDMA 2.5-|NDEA NDPA NDBA 图2 6种N-亚硝胺校准曲线 表2 6种N-亚硝胺线性相关系数和检出限 No. 化合物名称 相关系数r S/N (1ng/mL) 检出限 (ng/g) 1 NDMA 0.9996 12.06 0.249 2 NDEA 0.9995 129.94 0.023 3 NEIPA 0.9992 196.43 0.015 4 NDIPA 0.9996 80.51 0.037 5 NDPA 0.9999 33.28 0.090 6 NDBA 0.9991 16.81 0.178 2.3欧洲药典质量控制要求 按照药典要求，将对照品溶液重复测试6次，要求定量离子峰面积RSD%<20%，定量离子S/N>10， 定性离子 S/N>3。对浓度为3.75 ng/mL的对照品溶液进行测试，结果为定量离子峰面积RSD<7%，定量离子S/N>30，定性离子 S/N>10， 满足药典要求，具体结果见表3。 表3峰面积相对标准偏差(n=6)及信噪比 No. 化合物 定量离子峰面积 RSD% 定量离子定性离子 1 2 3 4 5 6 S/N S/N 1 NDMA 14，662 12，462 13，774 12，794 14，027 14，076 5.61 38.6 14.04 2 NDEA 11，593 12，187 11，557 13，528 12，449 11，705 5.70 424.6 184.1 3 NEIPA 26，193 26，530 26，695 27，714 26，188 25，196 2.96 920.7 65.2 4 NDIPA 9，804 9，676 9，772 11，085 10，714 10，541 5.28 264.4 139.8 5 NDPA 8，503 9，207 8，930 9，282 8，868 8，728 3.09 171.9 132.1 6 NDBA 772 743 741 808 787 686 6.22 115.4 28.3 2.4实际样品检测及加标回收 准确称取缬沙坦原料药样品250 mg，按照1.3的方法进行样品前处理，得到实际样品上机溶液。准确称取样品250 mg， 添加混合标准溶液，加标浓度为30 ng/g，此浓度为欧洲药典定量限，上机浓度为分别3.75 ng/mL，重复实验两次，定量结果及回收率见表4。 表4 实际样品测试结果及加标回收率 No. 化合物 样品中浓度 加标后浓度 平均回收率 (ng/g) 1 2 (%) 1 NDMA N.D 28.7 28.1 94.7 2 NDEA N.D 32.1 28.8 101.5 3 NEIPA N.D 29.7 28.1 96.4 4 NDIPA N.D 31.9 30.8 104.6 5 NDPA N.D 29.5 28.4 96.6 6 NDBA N.D 32.9 29.1 103.4 结论 本文建立了三重四极杆气质联用仪测定沙坦类药物中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质含量的方法。结果表明：在 1~50 ng/mL 的浓度范围内，6种N-亚硝线的线性相关系数 r为0.999以上，线性关系良好。将对照品溶液(3.75 ng/mL) 重复进样6次，峰面积的相对标准偏差 (RSD%) 小于10%，精密度良好，满足欧洲药典质量控制要求。实际样品在30 ng/g 的加标水平下，加标回收率为90%~105%。本方法参考欧洲药典 GC-MS/MS法检测沙坦类药中6种N-亚硝胺相关标准，可为沙坦类药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定提供参考。 岛津应用云 本文建立了三重四极杆气质联用仪测定沙坦类药物中6种N-亚硝胺类基因毒性杂质含量的方法。结果表明：在1~50 ng/mL的浓度范围内，6种N-亚硝胺的线性相关系数r为0.999以上，线性关系良好。将对照品溶液重复进样6次，峰面积RSD%小于10%，定量离子信噪比大于30，定性离子信噪比10，满足欧洲药典质量控制要求。实际样品在30 ng/g的加标水平下，加标回收率为90%~ 105%。本方法参考欧洲药典GC-MS/MS法检测沙坦类药中6种N-亚硝胺相关标准，可为沙坦类药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定提供参考。