全血中他克莫司检测方案(液相色谱仪)

Linda Cote， Siji Joseph， Sreelakshmy Menon 和 Kevin McCann 安捷伦科技公司 采用安捷伦三重四极杆 LC/MS/MS系统联合自动化在线样品净化技术快速分析全血中的环孢素A、依维莫司、西罗莫司以及他克莫司 应用简报 摘要 本研究建立了一种高灵敏度、高特异性的分析方法，用于定量分析一组环孢素A (CsA)、依维莫司(Eve)、西罗莫司(Sir)以及他克莫司(Tac)。该方法运行时间为2分钟，适于同时定量分析全血中的所有四种分析物。 Agilent Technologies 本应用简报介绍了一种采用 Agilent 1260 液相色谱系统结合配置了安捷伦喷射流技术的Agilent 6460 三重四极杆质谱仪，灵敏而准确地检测全血中四种免疫抑制药物，环孢素A(CsA)、依衣莫主 (Eve)、西罗莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac) 的分析方法。采用串联质谱仪 (MS/MS)和多反立监测(MRM)技术，该方法中 CsA 的线性范围为 1.95 ng/mL到2000 ng/mL， Eve、 Sir 和 Tac 的线性范围为0.10 ng/mL 到 100 ng/mL。 实验部分 试剂和标样 为开发分析方法，除环孢素 A-d4和未标记的依维莫司分别购于多伦多研究化学品公司和 Sigma-Aldrich 公司外，所有未标记和标记的标准品均购于 Cerilliant 公司。所有标准品均保存在-20°C环境下。使用气代模拟内标物 (ISTD)以确保准确定量。分析物及其对应的内标物在表1中列出。所有其他LC/MS 级溶剂和试剂均购于 Sigma-Aldrich和 Honeywell 公司。经认证的健康全血购于当地的一家血库。 此外，使用了来自 ChromSystems的校准品和来自 BioRad 的质控品 (QC)，以评估该方法的准确度和精密度(表9)。 为测定线性度，将标准品加入全血中得到高浓度校准标样， CsA 为 2000 ng/mL， Eve、Sir 和 Tac 每种为 100 ng/mL。然后用全血进行两倍连续稀释，以获取剩余标准曲线浓度。线性分析中用到的分析物浓度在表2中列出。 图1. CsA、Eve、Sir 和 Tac 的结构 表1.分析物及其对应内标物列表 分析物 内标物 环孢素A 环孢素A-d4 依维莫司 依维莫莫-d4 西罗莫司和他克莫司 子囊霉素 表2.本研究中所用的线性浓度 校准品 CsA (ng/mL) Eve， Sir， Tac (ng/mL) 11 2000 100 10 1000 50 9 500 25 8 250 12.50 7 125 6.25 6 62.50 3.13 5 31.25 1.56 4 15.63 0.78 3 7.81 0.39 2 3.91 0.20 1 1.95 0.10 样品前处理 表3.液相色谱条件 所有校准品、质控品和样品都采用一种简单的蛋白沉淀程序进行前处理： 1. 将 100 pL 的全血与 200pL含有内标的沉淀试剂(0.4M硫酸锌：甲醇为1：4)混合 2. 涡旋30s 3. 以 10000 rpm 的转速离心4分钟 参数 值 色谱柱 色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18， 2.1×12.5 mm， 5 pm (部件号821125-936) 分析柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3×50 mm， 2.7 pm (部件号699975-302) 柱温 60 °C 进样量 40 pL 针头清洗 1：1：1：1的甲醇：乙腈：异丙醇：水 + 0.1% FA 清洗 10s 4. 将上清液转移至自动进样器样品瓶中，并使用LC/MS/MS分析 表4.载样梯度(泵1) 表5.分析梯度(泵2) 液相色谱配置和条件使用 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统进行分析。该系统包括： Agilent 1260 Infinity 二元泵 (×2) 时间 流速 (mL/min) %B 0.00 0.1 50 0.01 2.5 50 1.50 2.5 50 1.80 0.1 50 2.00 0.1 50 带2位/6通色谱柱切换阀的 Agilent1260 Infinity 柱温箱 表6.阀切换时间 Agient 1260 恒温自动进样器 时间 位置 0.00 1 0.50 2 为提高仪器的稳定性，也推荐在自动进样器针座和进样阀之间使用在线过滤器(部件号5067-1551)。 液相色谱条件在表3、4、5和表6中列出。 自动化在线样品净化 本方法所用的 HPLC 采用两个二元泵以实现自动化样品净化(图2)。样品上样到捕集柱，分析物保留在柱内，然后使用第一个泵进行了冲洗。冲洗液流入废液容器，减少了 进入质谱仪的基质量。在分析物即将从捕集柱中洗脱时切换阀头，使洗脱的分析物进入分析柱，然后通过第二个二元泵进行进一步色谱分离。 图2.使用2位/6通阀和二元泵用于反吹液相色谱配置进行在线样品净化的阀位图示 采用使用了喷射流技术的 Agilent 6460三重四极杆质谱进行分析。独特的 MRM 转换离子对保证了对每种分析物定量分析的特异性。内标物(ISTD) 的使用减少了因样品前处理过程中分析物损失或者因样品基质差异而造成的误差。质谱条件和 MRM 转换离子对在表7和表8中列出。 表7.配置安捷伦喷射流源的 Agilent 6460三重四极杆质谱条件 参数 值 离子模式 正 干燥气温度 225°C 干燥气体流速 9 L/min 雾化器压力 35 psi 鞘气温度 325°C 鞘气流速 12 L/min 毛细管电压 4000 V DEMV 200 V 喷嘴电压 300 V Q1/Q3分辨率 0.7 unit 表8.监测的 MRM转换离子对 化合物 母离子 母离子 驻留时间(毫秒) 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) CAV 环孢素A-d4 1223.9 1206.8 10 170 12 4 环孢素 A 1219.9 1202.8 10 175 12 4 依维莫司-d4 979.6 912.5 10 170 12 4 依维莫司 975.6 908.5 10 185 12 4 西罗莫司 931.6 864.5 10 170 12 4 他克莫司 821.5 768.4 10 170 16 4 子囊霉素 809.5 756.4 10 175 16 4 数据分析 使用 MassHunter定量分析软件 (B0.040.01)进行数据分析。使用 MRM 峰面积与已知浓度的内标物峰面积的比值构建了所有分析物 的校正曲线。校正曲线的线性回归中采用的加权因子为 1/x。使用质控品进行了日间进样以评估回收率和重现性。图3为分析物特征 MRM 提取色谱图。 图3.环孢素A(A)、依维莫司(B)、西罗莫司(C)和他克莫司(D)定量 MRM 离子对色谱图 图4.环孢素A(A)、依维莫莫(B)、西罗莫司 (C)和他克莫司 (D)11种浓度，44个数据点校正曲线(类型：线性，原点：忽略，权重： 1/x) 结果与讨论 所有分析物都观测到了良好的线性，包含测试的所有11个浓度水平的线性曲线R²值都大于0.995(图4)。每种分析物保留时间的一致性保证了该方法的重现性。低线性浓度水平下对分析物足够的响应确保了实验中的最低浓度也得到了准确定量。 使用市售校准品 (ChromSystems) 和质控品(BioRad) 进行了日间进样以评估该方法的准确度和稳定性。数据由4名不同的操作人员在14天的时间内取得。每个浓度质控品的实测准确度在表9中列出。 结论 本研究使用 Agilent 6460 三重四极杆LC/MS/MS系统开发了一种高通量、运行时间为2分钟的分析方法，用于免疫抑制剂环孢素A、依维莫司、西罗莫司以及他克莫司的定量分析。经过简单的蛋白沉淀后，进行自动化在线样品净化，最大限度地减少了血液中生物化合物造成的基质效应和离子抑制。采用这种方法实现了全血基质中所有四种分析物可靠且快速的定量分析。所有分析物经证实在所需的范围内都具有良好的线性。 化合物 目标 (ng/mL) 平均值(ng/mL) 准确度(%) 变异系数(%) CsA 95.6 95.6 100.0 6.3 187.0 197.6 105.7 4.9 307.0 321.6 104.8 4.8 Sir 5.1 4.8 94.1 13.9 8.5 8.6 101.2 11.5 17.3 17.9 103.5 10.4 Tac 107.1 101.3 12.5 13.1 104.8 本研究建立了一种高灵敏度、高特异性的分析方法，用于定量分析一组环孢素 A (CsA)、依维莫司 (Eve)、西罗莫司 (Sir) 以及他克莫司 (Tac)。该方法运行时间为 2 分钟，适于同时定量分析全血中的所有四种分析物。