升麻中阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸检测方案(毛细管电泳仪)

分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第9期1261~1264第36卷2008年9月 第36卷分析化学1262 场放大进样胶束扫集法测定升麻中3种有机酸 李利军*1：1 蔡卓 李斯光 吴峰敏" 李海燕3陈昌东2 程昊' 吴健玲 (广西工学院生物与化学工程系，柳州545006) ‘(广西大学化学化工学院，南宁530004) '(中山大学中山医学院，广州510080) 摘 要 利用两种在线富集技术，对阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸同时测定的方法进行了研究。在胶束扫集的基础上，联用场放大进样，使富集倍数提高了约100倍；检出限降至4pg/L，线性范围向下延伸到10pg/L。胶束扫集电动色谱缓冲体系为90 mmol/L SDS+20 mmol/L Na， PO4(pH=2 20)+10%甲醇，分离电压20kV。进样电压10 kV，进样时间21s，进水时间210 s(H=20.0 cm)，测量波长214 nm。讨论了 SDS浓度、进样长度、进样电压等对分离效果的影响。在优化条件下，3种有机酸在 14min内出峰，峰面积 RSD≤3.8%。方法检出限(ug/L)线性范围(ug/L)、相关系数分别为：阿魏酸4.0、10~400、0.9982；异阿魏酸4.0、10~400、.0.9970；咖啡酸5.0、10~400、0.9980。回收率为83.9%~114.3%。 关键词 毛细管电泳，场放大进样，胶束扫集，阿魏酸，异阿魏酸，咖啡酸 1 引 言 针对毛细管电泳紫外检测器灵敏度较差的问题，出现了多种新技术、新方法，包括应用高灵敏度检测器、改造检测池和在线富集技术等，其中在线富集技术无需增加设备或改造检测池、操作简便，颇受重视。在线富集技术又大致可分3类：样品堆积胶束扫集和移动化学介面技术。其中样品堆积在进样时实现，可与后两种技术联用用4，5]，进一步改善灵敏度。本实验联用场放大进样和胶束扫集两种技术，对中药中3种有机酸的分离测定进行了研究。目前该联用技术报道甚少161] 胶束扫集和场放大进样均有高达1000倍以上富集倍数的报道17，81。前者利用带电胶束在电场的驱动下，扫过样品区带，捕集并富集样品，随后通过电动色谱分离；后者先在毛细管中充入缓冲液，再引进一小段水柱，接着电动进样。样品离子在电场的驱动下，迅速穿过水柱，进入背景缓冲溶液时突然降速，引起富集。两种技术联用的实验结果表明：(1)场放大进样基于电堆积，能大幅提高峰高；胶束扫集允许进样长度较长，能大幅增大峰面积；两者联用后，富集效果明显，峰高与峰面积同时增大、检出限降低；(2)可使线性范围增大；(3)重复性好，与胶束扫集法相比，峰面积和峰高的 RSD均无显著差异。 2005版药典规定以异阿魏酸含量作为衡量升麻质量的指标，故测定异阿魏酸的含量对质控有重要意义。阿魏酸、咖啡酸亦存在于升麻中，将本方法应用于升麻中3种有机酸的分离测定，结果满意。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 ACS2000高效毛细管电泳(北京彩陆公司)，未涂层毛细管(细50 um ×69.0 cm，有效长度43.0 cm)。检测波长 214 nm。 DL-60D超声波清洗器(上海之信公司)；Mettler toldedo Delta 320酸度计(瑞士梅特勒托利多公司)。 阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸对照品(中国生检所)；升麻(柳州桂中大药房)；NaH， PO4、H， PO、CH，OH (汕头西陇化工厂)；十二烷基磺酸钠 (SDS，汕头光华化工厂)。以上试剂均为分析纯。水为双蒸水。准确称取阿魏酸11.5mg，异阿魏酸 10.6mg，咖啡酸 12.3mg，分别用 CH，OH配成浓度为460、424 ( 和492 mg/L的对照品贮备液。电泳缓冲液用 100 mmol/L NaH， PO4、150 mmo l /L SDS储备液配制， ) ( 2007-12-02收稿；2007-12-31接受 ) ( 本文系广西自然科学基金(No. 0481019)资助项目 ) ( * Em ail： lilijun0562@ sina c om ) pH值用85% HPO调节。所有溶液进入毛细管前均用0.45um滤纸过滤，超声脱气。 2.2 实验方法 升麻样品经干燥粉碎后，过筛(孔径380um)，准确称取2500 g，于40 mL C HOH中超声萃取60 m in，过滤，滤液定容至50.00mL。测定时用水稀释200倍。场放大进样胶束扫集法：先重力引入水柱210 s(H=20.0 cm)，再电动进样(10 kV，21 s)，采用20 kV电压进行分离。 3 结果与讨论 3.1 电泳运行条件选择 为抑制电渗流，本实验选用磷酸盐缓冲体系。考察了不同 pH值，不同有机改性剂(甲醇、乙腈、异丙醇和乙醇)和不同分离电压对分离效果的影响，最终选定缓冲体系 pH220，甲醇(10%)为有机改性剂，分离电压为 20 kV，此时3种有机酸峰形理想，出峰时间短。 考察了 SDS浓度为60~120 mmol/L时3种有机酸的分离效果，结果见图1A。随 SDS浓度增加，峰 增高，出峰时间缩短。这是由于SDS增大了样品的容量因子。但是过高浓度的 SDS也会导致低导样品区带中形成的堆积区宽度增大]，引起峰增宽。本实验在SDS达 120 mmol/L时，出现了明显的峰增宽降低的现象。 虽然 SDS浓度为 100 mmol/L时，峰最高，但电流偏大，基线稳定性较差，为保证稳定性，实验选择 SDS浓度为 90 mmol/L。 图1 SDS浓度(A)和重力进样时间(B)对峰高的影响 Fig1 Effect of SDS concentration (A) and hydrodynam ic injection tme (B)1.异阿魏酸(isoferulic acid)；2.阿魏酸(ferulic acid)；3.咖啡酸(caffeic acid)。 3.2 胶束扫集进样时间确定 考察了进样时间为20~120 s(H=18.0cm)时样品峰高情况，如图1B所示，峰随进羊时间延长呈增高趋势。但由于进样时间>60s时，基线稳定性明显变差，易出现杂峰，柱效下降，故选择进样时间为60 s. 3.3 阴离子选择性场放大进样 3.3.11进水时间及进样时间选择 在进样时间为10和15s时，分别实验了不同进水时间时的出峰情况，得知进样与进水时间比约为110时，能得到较大的峰高及及效(见图2A)。保持此比例，考察了进样时间为15~27s的峰高情况。如图2B所示，随进样时间延长峰增高，但峰变宽，柱效有所下降。虽 15 图22进样时间与进水时间比(A)，进样时间(B)和进样电压(C)对峰高的影响 Fig 2 Effect of ratio ofwater injection tme to sample injection time(A)， injection time (B) and injection voltage(C) on peak height ( 1.异阿魏酸(isof e rulic acid)；2.阿魏酸(ferulic acid)； 3 .咖啡酸(caf f eic acid)。 ) 3.4实际样品分析 用场放大进样胶束扫集法对升麻提取液平行测定4次，经计算，中药升麻中3种有机酸的质量百分含量及RSD分别为：异阿魏酸0.0250%，4.0%；阿魏酸0.0162%，3.1%；咖啡酸0.0137%，4.9%。在化优条件下，进行回收实验，结果见表2。可见本法可用于中药升麻中异阿魏酸、阿魏酸、咖啡酸的含量测定。 然进样时间为24s时，峰仍增高，但是升麻提取液基体复杂，多种其它成分的浓度远高于被测物浓度，进样超过21s时，毛细管出现吸附现象，因而选择进样时间为21 s，进水时间为210s(H=20.0 cm) 3.3.2进样电压选择 电渗流速度和样品电泳速度均随电压增高而增大，但运动方向相反，且影响因子不同，因而电压可影响堆积效果。进样电压越大，电流也越大，产生的焦耳热也能影响堆积效果。实验考察了 6~14 kV时进样电压与峰高的关系(见图2C)。在电压10 kV时峰最高，富集效果最好，因而选择10kV为进样电压， 3.3.3 方法的性能 胶束扫集联用场放大进样后，三种有机酸的检测信号均显著增强(见图3)。在优化条件下，场放大进样胶束扫集法的性能列于表. 1。经计算，其峰高比胶束扫集增大了91~130倍，检出限降低了75~100倍，且方法重现性好，因而选用本法测定升麻中的异阿魏酸、阿魏酸和咖啡酸。基于信噪比3，各被测物检出限约0.50ug/L。 表 1 胶束扫集和场放大进样胶束扫集方法性能 Table 1L inerarity， Regression equation， and LODs by sweep ing and field amplified sample stacking (FASS) -sweep ing 胶束扫集 Sweeping 场放大进样胶束扫集 FASS-Sweep ing 分析物 线性范围 线性回归方程 检出限 线性范围 线性回归方程 检出限 富集倍数 Enhancement Analyte Linear range Regression 1 LOD L inear range Regression LOD (mg/L) equation (mg/L) (ug/L) equation (ug/L) 异阿魏酸 Isoferulic acid 0.50~20 v=701x+21.5 0.9993 0.30 10~400 ，=4'72x+55. 7 0.9970 4.0 109 阿魏酸 Ferulic acid 0.50~20 y=66 7x+9.90 ( 0.9995 0.30 10~400 y=5. 04x-27.3 } 0.9982 4.0 91 咖啡酸 Caffeic acid 1. 0~40 y=103x-43.00.9956 0.50 10~400 y=7. 36x+55.0 0.9980 5.0 130 图3标准品和升麻提取液电泳图 Fig 3Electropherograms of standard and rhizoma cimicifugae foetidae extraction solution A.标准品胶束扫集法(standard by sweep ing)； B.标准品场放大进样胶束扫集法 (standard by field amplified samplestacking (FASS)-sweep ing)；实际样品场放大进样胶束扫集法(real sample by FA SS-sweep ing)。缓冲溶液(buffer solu-tion)： 90 mmol/L SDS+20 mmol/L Na， PO4 (pH 2. 20)+10% CH，OH(V/V)；分离电压(separetion voltage)： 20 kV； 进样电压(injection voltage)： 10 kV；进样时间( injection time)： 21 s； 进水时间 (water injection time)： 210 s (H=20.0cm)。3种有机酸的浓度(concentration of three organic acids in standard)： A. 5. 00 mg/L； B. 200 pg/L。 1. 异阿魏酸(isoferulic acid)；2.阿魏酸(ferulic acid)； 3.咖啡酸(caffeic acid)。 表2升麻样品中3种有机酸的回收率 Table 2 Recoveries for three organic acids in rhizoma cim icifugae foetidae 被测物 加标量 Spiked 测得量 Found 回收率Recovery Ingredient (ug/L) (ug/L) (%) 64.2 60. 8 94.7 异阿魏酸 Isoferulic acid 38.5 40.1 104.2 96.2 110.0 114.3 45.9 38.5 83.9 阿魏酸 Ferulic acid 30.6 30.3 99.0 68.8 69.2 100.6 38.9 36.4 93. 6 咖啡酸 Caffeic acid 25.9 27.7 106.9 58.3 66.0 113.2 References ( 1 Quirino J P， Terabe S J. 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C Chrom atogr A， 2000， 892： 187~194 ) Determ ination of Three Organ ic Acids in Rhizoma C im ic ifugae Foetidaeby Capillary Electrophoresis Using Field-Am plified Sample Stackingand Sweep ing M icellar Electrokinetic Chroma tographic Techn ique LILiJun， CA I Zhuo，LI Si-Guang， WU FengMin，LIHai-Yan， CHENG Chang-Dong， CHENG Hao， WU JianL ing (Deparm ent ofB iological and Chen ical Engineering， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006)‘(College of Chen istry and Chen ical Engineering， Guangxi Univeisity， Nanning 530004)(Zhongshan School ofM edicine， Sun-YatSen University， Guangzhou 510080) Abstract Field amplified sample stacking (FASS)aand sweep ing micellar electrokinetic chromatography(FA SS-Sweep MEKC) was used for the detemm ination of ferulic acid， isoferulicacid， and caffeic acid Com-pare with the common sweep ing method， the sensitivity was mproved about 100 times by FA SS-Sweep， theLOD s was decreased to ug/L level， and the linear range was extended to 10 pg/L. The buffer medium con-tains 90 mmol/L SDS， 20 mmol/L NaH， PO4 (pH 2. 20)， and 10% methano1(V/V). Separation voltage was20 kV， sample injection voltage was 10 kV， injection time was 21S.water injection time was 210 sS(H=20. 0 cm)， detected at 214 nm. TThose of effect of SDS concentration， sample injection tme and injec-tion voltage were op tim ized Under the optimum conditions， the detem ination time was with in 14 minutes withRSD s of peak area less than 3. 8%. The calibration plots were linear in the range of 10 - 400 ug/L，r≥0. 9970， and the LOD s were 4 ug/L for ferulic acid and isoferulic acid， 5 ug/L for caffeic acidFurthermore， this p ropo sed FA SS-sweep ingMEKC method was successful applied for the detection of the three organ-ic acids in rhizoma cimicifugae foetidae Keywords Capillary electrophoresis， field amplified sample stacking，sweeping，1 ferulic acid.l，ii：soferulicacid， caffeic acid ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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