叶下珠中芦丁检测方案(毛细管电泳仪)

689第30卷第9期邓光辉等：毛细管电泳法测定叶下珠中芦丁的研究 690化 学 试 剂2008年9月 毛细管电泳法测定叶下珠中芦丁的研究 邓光辉*，刘榕城，张桂华，张美林'，韦耀龙' (1.广西民族大学化学与生态工程学院，广西南宁530006：2.广西大学化学化工学院，广西南宁 530004) 摘要：采用高效毛细管电泳法对叶下珠中芦丁的含量进行测定。研究了缓冲液的种类、浓度、pH、电泳运行电压、进样时间等因素对分离检测的影响。结果表明，以60 mmol硼酸盐(pH9.0)为缓冲液，16 mmol/L的 SDS为添加剂，检测波长为245nm，分离电压为15 kV，进样时间15s，芦丁在20~500mg/L线性关系良好(r=0.998)，回收率为98.9%，RSD 为2.1%，去法操作简单，回收率及重现性良好。 关键词：高效毛细管电泳；芦丁；叶下珠 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：0258-3283(2008)09-0689-02 叶下珠(别名珍珠草)为大戟科叶下珠属中的一种草本植物，具有清肝明目、解毒消肿的功效常用于治疗腹泻下痢、尿路感染、小儿疳积、肝炎、肾炎等疾病。叶下珠中主要含有芦丁、皮素等黄酮类化合物，其中芦丁可降低血管通透性、减少血管脆性和抑制糖制还原酶，有抗炎作用[2]，可用作高血压及动脉硬化的辅助治疗剂13]。毛细管电泳技术是一种近年来发展快速的分离分析技术，具有高效、快速、进样体积小和抗污染能力强等特点，在中药有效成分的分析中得到了广泛的应用。近年来，对芦丁的分离分析方法有梯度洗脱高效液相色谱法[4]，也有利用毛细管电泳法研究黄酮类化合物的报道15-71，但未见有利用毛细管电泳研究中药材叶下珠的报道。 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 CL2001高效毛细管电泳仪紫外检测器(北京彩陆科学仪器有限公司)；AB201-E电子天平(瑞士Mettler Toledo 公司) ；pH211C酸度计(北京哈纳科技有限公司)；石英毛细管柱75 um(I.D.) X55cm(河北永年光纤厂)；Nichipet EX微量移液器(0.5~10L和10~100L，日本Nichryo公司) ；UV/ Vis 916 紫外-分光光度计(澳大利亚 GBC公司) ；JP超声波发生器(武汉嘉鹏电子有限公司)；1810型石英自动双重纯水蒸馏器(江苏省宜兴市石英玻璃仪器厂)。 珍珠草(产自广西)；芦丁标准样品(中国药品生物制品检定所)；硼酸(分析纯，上海试剂总厂)；十二烷基磺酸钠(SDS)(分析纯，美国进口)；其他 试剂皆为普通市售分析纯；水为实验自备二次蒸馏水。 1.2 标准溶液及样品溶液的制备 准确称取一定量的芦丁标准品，用甲醇溶解定容，配制成1g/L的标准储备溶液。 取干燥的叶下珠，粉碎，准确称取20g加500mL水，用石灰乳调节pH8~9，浸泡24h。超声波萃取30 min，放冷过滤，加甲醇去除植物蛋白，过滤，使用前用0.45 um醋酸纤维滤膜过滤。 2 结果与讨论 2.1 检测波长的选择 采用紫外-可见分光光度计对芦丁水溶液进行扫描，得到芦丁的紫外最大吸收波长为245nm。因此选用245 nm作为分离检测波长。 2.2 缓冲体系的选择 因为芦丁含有多个羟基，而硼酸盐能够和羟基进行络合，生成络阴离子[8]，理论上硼酸盐是较好的分离体系。试验比较较硼酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-柠檬酸(Cit) 和 Tris-H，BO3 3 种不同浓度配比的缓冲溶液对分离的影响。结果表明硼酸盐体系能够得到较好的分离效果。 2.3 pH的影响 pH是影响分离度的一个重要因素。在60mml/L的硼砂中分别加入硼酸调节pH 为 8.0、8.59.09.5的缓冲体系。结果显示采用pH为 ( 收稿日期：2007-12-22 ) ( 基金项目：广西省科学基金项目(桂科自：0640038)资助。 ) ( 作者简介：邓光辉(1957-)，男，广西人，硕士，教授，主要从事天然产物化学研究。 ) 9.0的60 mmol/L的硼酸盐缓冲体系能获得较好的分离。 2.4 缓冲溶液浓度的选择 增加缓冲溶液的浓度，离子浓度增大，改变缓冲容量，减少溶质和管壁之间物质的作用，从而改善分离效果。缓冲溶液的浓度过大将产生大量的焦耳热，导致基线不稳，峰形变差。试验探讨了20、40、60、80 mmol/L几个缓冲溶液农浓度对分离检测的影响，试验结果显示，60 mmol/L的硼酸盐分离效果较好。 2.5 运行电压的选择 分离电压的大小不仅影响被测化合物的迁移时间，而且对分离度也有影响。高分离电压可以改善分离度，缩短分析时间。但是电压过高，毛细管内产生的焦耳热不容易散发，将引起柱效和分离度的降低，电压过低则分离时间过长。试验探讨了10、12、15、18kV4个运行电压，结果表日15kV分离效果最佳。 2.6 SDS 浓度的探讨 SDS是一种阴离子表面活性剂，具有吸附、增溶等功能。SDS浓度太低时，样品吸附导致峰形拖尾；SDS 浓度较高时，噪音较大，峰形较差。试验探讨了10、12、16、18 mmol/L SDS对分离效果的影响，结果显示当SDS浓度为16 mmol/L分离效果最好。 2.7 进样时间的选择 进样时间决定了进样量的大小。进样量太小，达不到检测器的灵敏度；进样量太大，样品塞 工作电压15 kV；进样时间15s (a)芦丁标准样品；(b)叶下珠样品 图1 芦丁标准样品溶液和叶下珠样品溶液的电泳图 Fig.1 Electropherogram of standard solution of rutinand phyllanthus urinaria L 长度超过扩散引起的区带增宽，使分离效率和分离度变差。实验探讨了5、10、15、20s4种进样时间，发现进样时间为15s时峰形最好。图1为选定实验条件下测得的芦丁标准品及叶下珠样品的电泳图。利用加入法以及比较标准电泳图与样品电泳图中标准物质的迁移时间两种方法进行定性。 2.8 标准曲线及重现性 精确配制不同浓度的芦丁标准样品溶液，以60 mmol/L的硼酸盐溶液为缓冲溶液，运行电压为15 kV，pH9.0，进样时间15s，检测波长为245 nm。以峰高为纵坐标(y)，以质量量度(mg/L)为横坐标(x)进行线性回归，得到线性回归方程为y=107451x-1858.5(r=0.998)，线性范围为20~500 mg/L，检出限为2mg/L。 取质量浓度为300 mg/L的芦丁标准溶液重复进样5次，峰高的相对标准准差RSD 值为1.98%，迁移时间的RSD 值为1.65%。 表1 峰的重现性 Tab.1 The peak height and migration time withreproducibility 2 3 4 5 平均值 RSD/% 峰高 8854 8956 9 109 8932 8817 8933 1.98 迁移时 间/min 15.445 15.337 15.764 15.827 15.941 15.490 1.65 2.9 样品分析 取提取的样品液稀释一倍，在选定的实验条件下，直接进样。在样品中加入一定量的芦丁标准样品，进行加标回收实验，平行测定5次，结果见表2。 表2 样品测定结果 Tab. 2 Determination results of samples (n=5) 样品 原有值/ 加入量/ 测得值/ 回收率/ RSD/% (mg g ) (mgg) (mg g ) (mgg) 芦丁 1.61 1.00 2.60 98.9 2.1 3 结论 采用高效毛细管电泳法对叶下珠中芦丁的含量进行测定。以60 mmol/L硼酸盐(pH9.0)为缓冲液，16 mmol/L 的 SDS 为添加剂，检测波长为245nm，分离电压为15 kV，进样时间15s，芦丁在20~500 mg/L线性关系良好(r=0.998)，回收率为98.9%，RSD 为2.1%，该法操作简单、快速、节能、回收率及重现性良好，可用于中药材叶下珠中芦丁的分析。 ( 氨酯预物中游离TDI研究[J].高校化学工程学报. 2005 ，19(2) ： 197-201. ) ( 3]李国兵，许春建，周明.刮膜分子蒸馏传质和传热的数学模型[J].天津大学学报：自然科学与工程技术版. 2003，36(3)：261-266. ) ( [4]闫广，李庆生，尹侠.刮膜式分子蒸馏过程的研究[J]. 南京工业大学学报：自然科学版.2005，27(2)：67-71. ) ( [5]余国琮，樊丽秋.降膜式分子蒸馏设备基本理论的探 讨[J].化工学报，1979，(1)：17-30. ) ( [6]FRENSDORFF H K ， ADAMS R K . 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The results showed that increasingdistillation temperature and rotating speed and decreasing operating pressure or feeding rate could favor the separation of TDI. Asemi-empirical formula for the mass transfer was deduced to adaptto the lacking in physical property data of polyurethane curing agent. This formula could be applied to separation of a smallamount ofsubstance， some physical property data of which werelacking. Key words ： short path distillation； separation； toluene diisocyanate(TDI) ；mass transfer ；model ( 高效毛细管电泳-电导检测[J].分析测试学报，2001，20 (6)：21-24. ) ( Determination of rutin i n phyllanthus u rinaria L . b y h ighperformance capillary electrophoresis DENG Guang-hui，LIU Rong cheng， ZHANG G ui-hud， Z HANG M e i-lin， W EI Y a o l ong (1 . E c ological P r oject I n stitute， Guangxi U n iversity f o r N a tionalities，Nanning 530006 ， China；2. S c hool of Ch e mistry andChemical E ngineering，Guangxi U niversity ，Nanning 530004，Chi na) ，Huaxue S hiji ，2008 ，30(9)，689~690；698 ) Abstract ：A method of high performance capillary electrophoresis ( was established for the d etection of rutin in phyllanthus urinariaL. Effects of several important f actors such as the pH and co n cerr tration of running buffer ，concentration of SDS ，operating vo l tage ， and i njection time ，were investigated. Under the optimized condrtion using 60 mmol/L of NaBO4 +15 mmol of SDS (pH 9.0) as the running buffer at a n operating voltage of 1 5 k V an d a det e c tion wavelength of 245 nm，the co n centration of rutin de m onstrat ed good l inear r elationship with the peak h eight i n the r ange of 20~500 mg/L (r=0 . 998 9 ) ，w i th the aver a ge reco v ery rat e reaching 98.9% and RSD equating to 2. 1 %. ) ( Key w o rds：high per f ormance capi l lary electrophoresis； rutin； phyllanthus urinaria L. ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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