升麻中阿魏酸、异阿魏酸检测方案(毛细管电泳仪)

分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷第9期2008年9月Vol.27.No.92008-9 第27卷第9期2008年9月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.27.No.92008-9 毛细管电泳同时分离测定阿魏酸、异阿魏酸的研究 李利军：*1冯 军，陈其锋锋，吴峰敏²，钟招亨2，孔红星，吴健玲' (1.广西工学院生物与化学工程系，柳州545006；2.广西大学化学与化学工程学院，南宁530005) 摘 要：建立了同时分离测定阿魏酸、异阿魏酸的毛细管电泳(CZE)新方法，以20 mmol/L 硼砂为背景电解质，体积分数15%异丙醇为有机改性剂，分离电压为20kV，在219 nm 波长下紫外检测。对硼砂浓度、有机溶剂体积分数、分离电压等因素对分离的影响做了系统的研究，最后确立了阿魏酸、异阿魏酸的最佳分离条件。阿魏酸、异阿魏酸分别在2.40~24.0 ug/mL、1.80~18.0 ug/mL范围内线性关系良好(r=09995和r=0.9991)，回收率分别为96.61%~101.9%，98.80%~101.8%。方法已用于升麻中阿魏酸、阿阿魏酸的测定。 关键词：毛细管电泳；阿魏酸；异阿魏酸；升麻 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2008)09-046-04 升麻为常用中药，以毛莨科升麻属植物升麻(Cimicifuga. foetida L.)根茎入药，具有发表透疹、清热解毒、升举阳气的功能，主要用于风热头痛、咽喉肿痛、麻疹不透，阳毒发斑等症。阿魏酸、异阿魏酸为升麻中两种主要活性成分，两者结构相似，为一对同分异构体，结构式见图1。在中国药典2005年一部中，明确规定以异阿魏酸的含量高低作为升麻的质量评价指标。因此，对阿魏酸、异阿魏酸含量测定具有重要意义。目前分离测定阿魏酸的方法主要为薄层扫描法、高效液相色谱法13.4]、、毛细管电泳法1，但同时分离测定阿魏酸、异阿魏酸的方法仅见高效液相色谱法16~8]，由于阿魏酸、异阿魏酸结构相似，两者的分离时间较长。毛细管电泳以其柱效高，分离速度快，试剂和样品消耗少、成本低，且耐污染，在中草药及其制剂的分析中有着高效液相色谱无法比拟的优点。但未见用于阿魏酸、异阿魏酸同时分离测定的报道。 本文建立了用毛细管电泳法(CZE)同时分离和测定升麻中阿魏酸和异阿魏酸的方法，为升麻药材及其复方制剂的质量控制提供了一种新的高效、快速的实验技术。 图1 阿魏酸(a)、异阿魏酸(b)结构式 Fig.1 Molecular structures of isoferulic acid and ferulic acid 实验部分 1.1 仪器和试剂 ACS2000 型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司)、正电源：电压0~30 kV 可调、未涂层熔融石英毛细管中75 um，总长60 cm、有效长度45cm、检测波长219 nm。UV-2102PC型紫外-可见分光光度计(UNICO instrumentsSCO.，LTD)；DL-60D超声波清洗器(上海之信仪器公司)。 阿魏酸、异阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。硼砂、NaOH、异丙醇等试剂均为分析纯。水为二次重蒸馏水。升麻(柳州市中医院)。 1.2 电泳条件 电压20kV；重力进样，进样高度：11cm；进样时间30s；检测波长219 nm；环境温度：255 ℃：硼砂浓度为20 mmol/L，体积分数15%异丙醇水溶 ( * u 收稿日期：2007-05-06；修订日期：2007-08-10 ) ( 基金项目：广西自然科学基金(桂科自No.0481019)和广西教育厅科学研究基金(桂教科[2000]392)项目资助 ) ( 作者简介：李利军(1966-)，男，教授； E mail： lilijun0562 @sina. com ) 液。 1.3 实验方法 1.3.1 毛细管的处理 每天实验前依次用1mol/L NaOH溶液、水分别冲冼 15 min，进样前用缓冲液冲洗 30 min，实验4h后更换缓冲液。实验结束后用水冲洗，并用水浸泡过夜。实验所用的溶液进样前均用0.45 um的滤膜过滤，并经超声波脱气30 min。 1.3.2 样品预处理 取升麻10g干燥至恒量，研磨，过孔径0.38mm筛后称取升麻粉末1.000 g，加入20mL甲醇溶液，加热回流60 min，放冷至室温，用0.45 um滤纸过滤后定容至25.00 mL。将滤液稀释5倍后进行测定。 1.3.3 标准贮备液配制 准确称取阿魏酸对照品0.0072g，用甲醇溶解，定容至10.00mL，配制成浓度为720.0ug/mL 的阿魏酸对照品贮备液；精密称取异阿魏酸0.0090 g，用甲醇溶解，定容至25.00mL，配制成浓度为360.0 ug/mL 的异阿魏酸贮备液。上述溶液均用0.45 pm滤纸过滤，超声除气，置冰箱4℃保存。 2 结果与讨论 2.1 分离条件选择 2.1.1 检测波长的选择 实验以缓冲介质为参比液，对阿魏酸、异阿魏酸溶液在200~400 nm 波长之间进行扫描，发现阿魏酸、异阿魏酸在219nm处附近均有较强吸收，因此实验选取219 nm 作为检测波长。 2.1.2 缓冲体系的选择 随着pH的增加，两种酸带电荷量增加，电泳速度增加，表观淌度减小，所以两种酸的迁移时间延长。在pH8.5~9.5范围内，两种酸能完全分开且迁移速率较快。pH大于9.0时，由于加入的碱增多，导致离子强度增加，热效应增加，电流迅速上升，不利于分析测定，因此本实验选的最佳pH为9.0。 电泳缓冲溶液浓度对各个被分离组分的迁移时间、分离度、柱效等均有较大影响。考察了硼砂从10~30 mmol/L的浓度范围，发现在硼砂浓度逐渐升高时，硼砂与两种酸的络合使得两种酸带电荷增加，表观淌度减小，所以迁移时间增加，分离度逐渐增大，柱效较高。但是噪音随之增大、电流值上升很快、基线漂移现象严重、灵敏度下降、检出限升高。硼砂浓度太低则缓冲容量不够，故综 合考虑选择硼砂浓度为 20 mmol/L。 2.1.3 有机溶剂的选择及体积分数的影响 在CZE中，有机溶剂作为一种改性剂，常常加到缓冲溶液中，以改变毛细管熔硅管内壁和缓冲溶液的性能，可提高分离度和选择性，且对于疏水物质有增溶作用。由于升麻样品中其它物质的干扰影响阿魏酸和异阿魏酸的准确测定，故需加入有机溶剂以改善阿魏酸和异阿魏酸与升麻样品中其它物质的分离度。本实验考察了缓冲溶液中不加有机溶剂、加入相同体积分数的甲醇、乙腈及异丙醇时，阿魏酸和异阿魏酸和其它干扰物质的分离情况。结果表明，缓冲溶液中不加有机溶剂时，干扰物质很多，使阿魏酸和异阿魏酸无法准确进行定量。加入甲醇或乙腈后，分离度有所改善，但仍然存在杂质干扰，用异丙醇作为有机溶剂改性剂后，阿魏酸和异阿魏酸峰形良好，与杂质分离很好，故本实验选择异丙醇为有机溶剂改性剂。考察了异丙醇的体积分数0%~20%，实验结果表明，加入异丙醇体积分数>15%后，阿魏酸和异阿魏酸有较好的分离度，但同时迁移时间延长，分析周期较长，综合考虑分离度与分析周期两方面因素，选用异丙醇体积分数为15%。 2.1.4 分离电压的选择 实验考察了电压为13~23kV时的试验效果，电压较低时，基线稳定，但样品的分析周期长；随着电压的增加，样品的分析时间缩短，峰形尖锐，在20 kV时分离度达最好具有较短的分离时间、较高的柱效，防止基线漂移、降低噪音，综合考虑选用20 kV作为分离电压。 2.2 样品提取方法的选择 对比了甲醇超声提取1h和加热回流提取1h的提取率。结果表明，加热回流提取相对超声提取率高，阿魏酸达到0.0646%，异阿魏酸达到0.1063%，与参考文献相符。故选择甲醇加热回流提取的方法。 2.3 线性关系的考察 在上述选定的最优条件下对阿魏酸、异阿魏酸混合标准溶液进样，两种对照品溶液电泳图见图2(a)。 取阿魏酸对照品贮备液(720.0 ug/mL)稀释为2.40、3.60、7.20、18.0、24.0 ug/mL 的标准溶液。按上述的试验方法，对不同浓度的阿魏酸标准溶 液平行测定5次，由平均峰面积与浓度(ug/mL)计算线性方程为：Y=469.77p+758.59，r=0.9995，线性范围为：1.44~18.0 ug/mL。 取异阿魏酸贮备液(360.0ug/mL)稀释为1.80、3.60、7.20、14.4、18.0 ug/mL的标准溶液。按上述的试验方法，对不同浓度的异阿魏酸溶液平行测定5次，由平均峰面积与浓度(ug/mL)计算线性方程为：Y=387.9p+88.18，r=0.9991 ，线性范围为：1.80~18.0 ug/mL. 2.4 重现性试验 取同一规格、品种升麻样品5份，按样品预处理项下制备供试品溶液，测得阿魏酸平均值为0.0646%，异阿魏酸平均值为0.1063%，其 RSD 分别为1.6%、3.6%。 2.5 稳定性试验 取上述对照品溶液，每隔1h进样，连续10h，结果10h内阿魏酸和异阿魏酸的峰面积积分值基本稳定，峰面积的RSD 分别为2.6%、2.2%。 图2 阿魏酸、异阿魏酸对照品(a)及升麻样品(b)电泳图 Fig.2 Electropherograms of standards and samples 1-异阿魏酸；2-阿魏酸 电泳缓冲液为20 mmol/L硼砂，15%异丙醇，电压20 kV，紫外检测波长219 nm 2.6 样品测定及加标回收实验 将升麻提取液，在实验条件下平行测定5次，样品电泳谱图见图2(b)。经计算，升麻提取液中阿魏酸和异阿魏酸测定结果见表1。结果符合中国药典2005版一部以异阿魏酸含量计不低于0.10%的规定[1]。同时按照实验方法进行回收率实验，其结果见表1。 表1 样品测定结果 Tab.1 Results of recovery test 分析物 加标量 测出量 RSD/% 回收率 p/(ug/mL) /(ug/mL) (n=5) /% 6.00 6.12 2.1 101.9 阿魏酸 8.00 7.89 4.3 98.7 10.0 9.66 1.7 96.6 异阿魏酸 4.80 4.88 4.1 101.8 6.00 6.03 2.9 100.4 7.20 7.11 2.9 98.8 由表1可知，阿魏酸的回收率在96.6%~101.9%之间，异阿魏酸的回收率在98.8%~101.8%之间。其RSD 均小于4.3%。表明方法具有较好的重现性和准确度，可用于升麻中阿魏酸和异阿魏酸的测定。 ( 参考文献 ) ( ] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社，2005.50 ) ( 姬生国，王 东. 西 北药学杂志，2002，17(4)：1 5 1 ) ( Shi Zh H， He J T， Zhao M P et al. 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The operating buffer was composed of 20 mmol/L disodium tetraboratedecahydrate and 15 %(V/V) isopropanol. The applied voltage was 20 kV and the UV detection wavelength was 219nm. The linear ranges of the method were 2.40~24.0 ug/mL (r=0.9995) for ferulic acid and 1.80~18.0 ug/mL(r=0.9991)for isoferulic acid. The recoveries were 96.61%~101.93% and 98.80%~101.78 % respectively.This method is simple ， rapid and accurate. It had been successfully used for the determination of ferulic acid andisoferulic acid in Cimicfuga foetida. Key words： Capillary electrophoresis； Ferulic acid； Isoferulic acid； Cimicfuga foetida 欢迎订阅 欢迎投稿 欢迎刊登广告 《冶金分析》2009年征订启事 国内统一刊号： CN11-2030/TF国际标准刊号： ISSN1000-7571国际 CODEN码：YEFEET邮发代号：82-157国外代号：1579BM广告经营许可证号：1000004000026 作为冶金领域中权威的分析技术专业期刊，《冶金分析》的办刊宗旨是为广大冶金分析测试工作者搭建学术交流平台。《冶金分析》由钢铁研究总院和中国金属学会合办，国际钢铁工业分析委员会(ICASI)支持。自1981年创刊以来，《冶金分析》以高度的创新精神和严谨的科学态度，动态反映冶金领域分析测试新技术、新方法、先进经验，报导研究成果，发表综述文章，并介绍国内外冶金分析动态等。适合于冶金、矿山、石油、化工、机械、地质、环保、商检等部门技术人员和大专院校师生参考。《冶金分析》是中国科技论文统计源期刊、中国科学引文数据库的核心库期刊、全国中文核心期刊、美国“CA"千种表中国化工类核心期刊，90年代初期就为美国工程索引EI数据库收录，并为中国期刊网、万方数据网等国内知名数据库所收录。 多年来《冶金分析》的影响因子等重要学术评价指标在冶金工程技术类及分析测试技术类期刊中一直居于前列。据2007年10月发布的《中国学术期刊综合引证年度报告》，本刊2006年度影响因子为1.041，分别在“冶金工程技术类”、“分析测试技术类”统计源期刊中均名列第二。 为了加强国际间学术交流，促进冶金分析测试技术发展，在国际钢铁工业分析委员会(ICASI)的支持下，一批国外知名专家担任本刊编委。本刊将致力于以最快的速度及时发表国内外的最新研究成果。 《冶金分析》为月刊，大16开，单期页码为80页，定价15.00元，全年12期，180.00元。全国各地邮局发行，如有漏订的单位和读者，请直接与编辑部联系。 欢迎订阅!欢迎投稿!欢迎刊登广告! 地址：北京海淀区学院南路76号 邮编：100081 网址： www. yejinfenxi. cn 电话/传真：010-62182398 E mail ： yjfx @analysis. org. cn； yjfx @chinajournal. net. cn China Academic Journal Electronic Publishing House. 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