胡黄连中肉桂酸检测方案(毛细管电泳仪)

广西工学院学报JOURNAL OF GUANGXI UNIVERSITY OF TECHNOLOGYVol.16 No. 4Dec. 2005第16卷第4期2005年12月 第4期孔红星等：毛细管区带电泳分离测定胡黄连中的肉桂酸67 文章编号1004-6410(2005) 04-0066-03 毛细管区带电泳分离测定胡黄连中的肉桂酸 孔红星1，黄文艺2，冯 军2，李利军1 (1.广西工学院生物与化学工程系，广西柳州 545006；2.广西大学化学化工学院，广西南宁 530004) 摘 要：利用毛细管区带电泳对中草药胡黄连中的肉桂酸进行了分离和测定：重力进样，进样高度为15 cm，进样时间 30s，单性石英毛细管内径 75 pm，总长 60 cm，有效分离长度42 cm，分离电压-18 kv，在 50 mmol/L，pH=8的硼砂缓冲溶液中加入 0.5 mmol/L 的十六烷基三甲基溴化铵作为电渗流改性剂，以 30%(V/V)的乙醇水溶液为溶剂，以苯甲酸为内标物采用内标定量。分离效果良好，测定结果较为理想。 关 键 词：毛细管区带电泳；胡黄连；肉桂酸 中图分类号：O657.8 文献标识码：A 0 前言 肉桂酸具有抗菌、消炎、升白细胞、利胆、抗实体瘤活性等药理作用11.2J，在很多中草药中都作为主要成分存在，肉桂酸含量的高低也被作为一些中草药的品质评价指标，因此中草药中肉桂酸含量的测定具有重要意义，目前利用高效液相色谱仪测定肉桂酸含量的方法很多[3~5]，相比于高效液相色谱，高效毛细管电泳更具有操作简单，维护方便，分离速度快等优点，在中草药有效成分的分离测定方面应用越来越广泛。本课题组曾利用非水相毛细管电泳测定桂枝中肉桂酸的含量，但由于非水介质电导率小，电渗流小，因而分离时间长[6].由于肉桂酸在水中的溶解度低，本文研究了利用毛毛管管带电泳分离测定中草药中肉桂酸含量的方法，并用于胡黄连中肉桂酸的含量测定，实验结果较为理想。 材料与方法 1.1 材料与仪器 肉桂酸、氢氧化钠、硼砂、磷酸氢二钾、氯化铵、乙醇、十六烷基三甲基溴化铵均为国产分析纯，配制溶液用水为二次蒸馏水，所有溶液均经0.45 um 微孔滤膜过滤，胡黄连中药材店购买。 ACS2000 型高效毛细管电泳仪包括负电源(电压0~-30kv可调)和毛细管(g=75um，总长 60cm，用于分离的有效长度为42 cm)(北京彩陆科学仪器有限公司)；UV-2102PC 型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；分析天平(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)。 1.2 试验条件 实验室环境温度25℃，重力进样，进样高度15 cm，进样时间30s，分离电压-18 kv，于 220 nm 阳极直接检测。 1.3样品制备 将样品在60℃下恒温干燥 24h，磨碎后准确称取1.0000g用80 mL左右的无水乙醇浸提，在超声波照射下提取 30 min，然后冷浸 24 h，过滤，滤渣用 15 mL 无水乙醇在超声波照射下提取 30 min 后过滤，两次滤液合并后用无水乙醇定容至100 mL 备用。 ( 收稿日期 ：2005-11 -08 ) ( 基金项目：广西自然科学基金资助项目(0481019)资助；广西教育厅科研基金资助项目(2000392)。 ) ( 作者简介：孔红星(1967-)，男，湖北应城人，广西工学院生物与化学工程系高级工程师，硕士研究生。 ) 2.1 分离条件的选择 2.1.1 缓冲溶液 分别利用 50 mmol/L 的硼砂、磷酸氢二钾、氯化铵作为缓冲溶液用 100 g/mL的肉桂酸溶液进行电泳试验，实验表明硼砂的分离效果较好，故选择硼砂作为缓冲溶液。硼砂浓度越高，分离效果越好， 但提高硼砂浓度并不能得到理想的分离效果，而当向缓冲溶液中加入一定量的乙醇后，分离效果良好，但硼砂在乙醇中的溶解度较低，较高的硼砂浓度会影响乙醇的加入量，从而降低分离效果，综合考虑，选取 50 mmol/L 的硼砂作为缓冲溶液。 2.1.2 溶剂 肉桂酸在水中的溶解度很低，以水作为缓冲溶液的溶剂时，肉桂酸的吸收峰拖尾严重，影响测定，在缓冲介质中加入乙醇后，拖尾现象得到改善(见图1)，添加乙醇的量越多，效果越好，但过多的乙醇添加量会使硼砂结晶，堵塞毛细细，同时也会使电渗流降低，延长分离时间，综合考虑采用30%(V/V)的乙醇水溶液作为缓冲液的溶剂。 2.1.3改性剂肉桂酸是带负电荷的基团，在电泳过程中其流动方向与电渗流方向相反，添加电渗流改性剂可减少分离时间，在缓冲溶液中添加0.5 mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵，其改性效果良好。 图1 肉桂酸在不同溶剂下的吸收峰 A H2O B 30%乙醇 2.1.4pH值 肉桂酸是一种弱酸，高pH值对分离有利，但pH 值升高会使硼砂的溶解度降低，当pH超过9时，50 mmol/L 的硼砂缓冲溶液会在毛细管中结晶析出堵塞毛细管，影响分离测定，综合考虑选择pH=8，实验结果表明分离效果较好。 2.1.5内标物肉桂酸是带有苯环结构的有机酸，苯甲酸的结构与之相近，检测方便，且两种酸在本文所选分离条件下易于分离，且在样品的分离图谱中未见苯甲酸的吸收峰，故选取苯甲酸作为内标物。 2.1.6 检测波长 用紫外分光光度计测定肉桂酸和苯甲酸的紫外吸收图谱，见图2，图中肉桂酸的最大吸收波长在273 nm 处，但在此波长下，内标物苯甲酸的吸收较弱，而在220 nm 处，肉桂酸和苯甲酸都有较强吸收，故选取 220 nm 作为检测波长。 2.2 定量方法 2.2.1 料精确度与重复性试验 用 50 pg/mL 的肉桂酸和苯甲酸溶液重复试验6次，作精确度和重复性试验，试验结果为：保留时间的相对标准偏差 RSD=0.956%，峰高比值的相对标准偏差 RSD=3.45%。 图2 肉桂酸和苯甲酸的紫外吸收光谱 (1)肉桂酸 (2)苯甲酸 2.2.22工作曲线的制定在5~200 pg/mL范围内，分别用峰高和峰面积作为定量依据，用内标法和外标法测定了工作曲线，结果表明：内标法定量线性度比外标法好，以峰高作为定量依据优于峰面积，其线性范围比外标法大很多。故本文以峰高作为定量依据，以内标法定量。采用内标法定量，肉桂酸的检出限为0.2 pg/mL，在5~500 pg/mL 范围内工作曲线为C=21.51×H-1.094，线性相关系数为0.996。 2.3 样品测定与加标回收率试验 2.3.1 技提取方法肉桂酸在水中的溶解度较小，而在乙醇中的溶解度较大，且溶解速度快，采用乙醇作为萃取剂来提取肉桂酸。加热回流是一种较快的提取方法，但加热回流的提取物中含有较多的水不溶物，在毛细管中易析出而堵塞毛细管，而冷浸提取物则不会发生毛细管的堵塞现象，本文分别采用加热回流30min和冷 浸24h两种提取方法，试验结果表明，两种方法的测定结果基本相同，故本文采用冷浸的方式提取肉桂酸。 表1 样品分析结果 (n=6，pg/mL) 2.3.2样品测定将提取的待测样品加入内标物后用0.45 m 的滤膜过滤后用于测定，胡黄连的分离图谱见图3，然后做加标回收率试验，RSD 小于3.5%，加标回收率在95%~104%，结果见表1。 测定值 RSD(%) 加标量 加标测定值 RSD(%) 加标回收率(%) 10 23.0 3.1 95 13.5 3.5 20 33.3 2.8 99 30 44.7 1.6 104 3 结论 作为一种分离效率高，操作简便的分离测定工具，高效毛细管电泳在中草药的品质控制方面的应用越来越多，对于胡黄连中肉桂酸的含量的测定，在溶剂中加入一定量的乙醇可以提高肉桂酸的溶解度，改善峰形，以30%(V/V)的乙醇水溶液作为缓冲液的溶剂，50 mmol/L 的硼砂作为缓冲溶液可得到较好的分离效果，该法分离测定速度快，结果准确可靠。 图3 分离图谱 ( 参 考 文 献： ) A样品， B对照品；1内标物， 2肉桂酸 ( [1]柯铭清.中草药有效成分理化与药理特性[M].长沙：湖南科学技术出版社，1982. ) ( [2] Liu L， Hugins WR， Shack S， et al. Cinnamic acid： A n a tu r al product with potential use in cancer in t ervention [J]. Int J Cancer，1995，62(3)：345. ) ( [3]罗晋萍，张中苏，田 晨.高效液相色谱法测定桂龙咳喘宁胶囊中肉桂酸的含量[J].药物分析杂志，2000，20(3)：200- 201. ) ( [4]黄晓红，宋宗华，李秀琴，等. RP-HPLC 测定苓桂术甘方中肉桂酸的含量[J].中成药，2002，24(10)：764-765. ) ( [5]王 琰，周小梅，刘建祯，等.高效液相色谱法测定桂枝中3种有效成分的含量[J].药物分析杂志，2003，23(2)：128-130. ) ( [6]李利军，黄文艺，孔红星，等.非水相毛细管电泳——紫外检测法的研究[J].广西工学院学报，2004.15(4)：1-4. ) Determination of cinnamic acid in medicinal herbby capillary zone electrophoresis KONG Hong-xing'， HUANG Wen-yi²，FENG Jun’， LI Li-jun' (1. Department of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University ofTechnology， Liuzhou 545006，China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China) Abstract： Cinnamic acid in medicinal herb rhizoma picrorhizae was separated and determined by capillary zoneelectrophoresis with benzoic acid as the internal standard. The separation and determination conditions were as (下转第77页) Study on production of riboflavin withwaste water or residues of food industry SONG De-gui， WEI Jun， YANG Sheng-yu (1. School of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin 541004， China； 2. Zhengzhou Light Industry College， Zhengzhou 450052， China；3. Henan University， Kaifeng 475001， China) Abstract： In this article， the production of riboflavin with waste water or residues of food industry byeremothecium ashbyii was studied. Results of the orthogonal test showed that the optimum culture mediumcomprises 15 g resides of bean curd production， 4. 5 g wheat bran， 4.5 g millet， 3. 0g corn and supplementedwith 81 ml H2O， pH 6. 5. The optimum ferment temperature was observed at 28℃. The maximum amount ofRiboflavin was found approximately on 13th day. Key words： riboflavin； eremothecium ashbyii； fermentation； orthogonal test ( (责任编辑 赖君荣) ) (上接第68页) follows： gravitation sampling， the height is 15cm， the time is 30 sec； running voltage is -18kv； bouncy silica ：75 um i. d.， total length 60 cm， 42 cm from the inlet to UV detection； electrolyte： 50 mmol/L sodiumtetraborate and 0.5 mmol/L cetyl trimethyl ammonium bromide， pH=8， solvent is 30%(V/V) ethyl alcoholand water. The result proved to be satisfactory. Key words： capillary zone electrophoresis； rhizoma picrorhizae； cinnamic acid ( (责任编辑 赖君荣) ) (上接第72页) Other material resources are compared for the preparations of CCM. Using the above conditions， it was foundthat the productivity of CCM from oysters is higher than that from the clam shells. However， the solubilities ofboth types of CCM are excellentt.. The amounts of the 29 trace and heavy elements in oyster CCM are inaccordance with the criterions of Chinese and US government regulations for calcium additives. Key words：calcium supplement；oyster shells；clam shells； calcium citrate-malate； Chinese herb ( (责任编辑 赖君荣) )