阿莫西林胶囊中定量及定性分析检测方案(近红外光谱仪)

近红外漫反射光谱法对阿莫西林胶囊的定量及定性分析 沈漪潘颖 刘全’项竞佐 (1.上海市药品检验所上海200233；2.美国 Thermo Nicolet公司) 摘要 目的：采用近红外漫反射光谱分析技术对阿莫西林胶囊进行定量和定性分析。方法：按阿莫西林胶囊配方组成配制含主药阿莫西林浓度范围从 5.91%~84.13%的32个实验室样品，并收集来源于九个厂家的41批工业样品，采集其近红外光谱。分别采用偏最小二乘回归和判别分析法建立定量和定性分析模型，将其用于对未知样品含量进行预测分析，并对定量分析方法的重现性和加样回收率进行考察。结果：定量分析模型对24个未知样品的的预测均方差 RMSEP 为1.22%，预测值与真值的相关系数R为 0.9983，加样平均回收率为99.75%，系统精密度 RSD 为0.3%，方法精密度 RSD 为 0.6%；定性分析模型对18个预测样品的判错率为0%。结论：用近红外光谱分析技术对阿莫西林胶囊进行定量和定性分析结果准确可靠，方法简便快速，不需预处理，可推广用于此类样品工业现场的原位和在线检测。 关键词 近红外漫反射光谱阿莫西林定量分析 Determination and qualitification of the Amoxicillin Capsules byNIR Diffuse Reflectance Spectroscopy Shen Yi ， Pan ying， Liu Quan ， Xiang Jingzuo (1.SShanghai Institute for Drug Control， Shanghai 200233)(2. Thermo Nicolet corporation，U.S.A) AbstractObjectiveTo determinate and qualitification of the amoxicillin capsule by near-infrared (NIR)Diffuse Reflectance Spectroscopy.MethodWe prepared 32 samples which concentration range of amoxicillinis from 5.91%to 84.13%， at the same time collect 41 batches samples which came from 9 factories ， then usePartial least square(PLS) to build the calibration model to predict the concentration of unknown sample， andexamine the method reproducibility and recovery. We use discriminant analysis to build classificationmodel.ResulttA model was set up using a calibration set (73 samples). The determination coefficient R is0.9994， which came from cross-validation， and root mean square error of cross-validation (RMSECV) is 0.96.Root mean square error of prediction (RMSEP) obtained from the validation including 24 unknown samples is1.22%， the correlation coefficient between the true value and prediction value is 0.9983. The average recovery is100.25%， RSD of the system precision is 0.3%， RSD of the method precision is 0.6%. The misclassified rate is 0%on the qualitification model using discriminant analysis.Conclusion The results show that the predict modelusing NIR is reliable， the method is fast and exact， and can be applied to on-line detection. Key words near infrared， diffuse reflectance spectrophotometry， amoxicillin， quantitative analysis 近红外 (Near Infrared， NIR)光谱是指处于可见光和中红外光之间，波长范围为780-2500 nm(12000-4000 cm)的一段谱区，其光谱信息主要反映的是有机物分子中C-H、N-H、O-H等含氢基团的倍频与合频吸收。由于谱带严重重叠，谱峰难以分辨，该谱区曾一度被称为“光谱技术中的沉睡着”[2]。近几年来，随着化学计量学技术的发展及先进光谱仪器的出现，人们重新认识了它的价值。目前，NIR光谱分析技术因其快速、无损、多成分同时测定等特性，已被广泛应用于农业31、石油[4]、化化工S]等行业，而在医药领域，它已被成功用于包括原辅料[61、制剂I7，8]、生产过程等几乎所有环节的定性和定量分析。 阿莫西林 (Amoxicillin) 胶囊是一种口服半合成青霉素，具有抗菌谱广，杀菌力强，毒性低等特点，适用于轻中度感染，已广泛应用于临床。目前其含量测定方法为高效液相色谱法，该方法需进行复杂的样品制备和预处理工作，不能用于工业现场的原位快速分析。 本文以阿莫西林胶囊为例，按一个厂家的制剂配方配制了32个样品，同时收集了九个厂家的阿莫西林胶囊制剂共41批，采集其近红外光谱，分别应用偏最小二乘回归算法(PLS)和判别分析技术建立了定量和定性分析模型，并对未知样品进行预测分析。结果证明，该方法准确可靠，可推广用于此类样品工业现场的定性和定量快速检测。 仪器与样品 Antaris 傅立叶变换 NIR 光谱仪(美国 Thermo Nicolet公司)，配有积分球漫反射采样系统， Result 操作软件， TQ Analyst 6.2分析软件； 阿莫西林原料(纯度86.74%)，辅料硬脂酸镁、淀粉为药用规格。按阿莫西林胶囊配方组成配制含主药阿莫西林浓度范围从 5.91%~84.13%的32个实验室样品。 九个厂家的阿莫西林胶囊制剂共41批，分别是：昆明贝克诺顿制药有限公司4批，上海衡山药业有限公司8批，香港澳美制药厂5批，香港联邦制药厂有限公司4批，丽珠集团丽珠制药厂4批，浙江金华康恩贝生物制药有限公司4批，甘肃兰药药业集团有限责任公司4批，海南三叶制药厂有限公司4批，山东鲁抗医药股份有限公司4批。 2 NIR 光谱采集 将样品分别装于样品瓶中，在10000~4000 cm 波数范围内采集其NIR光谱，扫描次数40次，分辨率8cm°，每个样品重复3次，取平均值。图1为阿莫西林和辅料的NIR光谱图。图2和图3分别为32个实验室样品及41个工业样品的原始光谱及--阶导数光谱。 图1阿莫西林和辅料的 NIR 光谱图 Fig.1 NIR spectra of excipient and amoxicillin 1.辅料(excipient)2.阿莫西林 (amoxicillin) 图2样品的原始 NIR 漫反射光谱图 图3一阶导数光谱图 Fig.2 Original NIR spectra Fig.3 First derivative spectra 3 定性分析 将九个厂家41批样品的NIR光谱图用判别分析法建立定性分析模型。采用一阶导数，并选取光谱波数范围为 9881.5-4119.2cm°，作为建模参数，并用建立的模型对其中18个未知样品进行预测，以验证模型的预测效果，结果判错数为0，证明该模型能很好的对建模的九个厂方的样品进行识别。其优化过程如下： 3.1光谱范围及数据处理方法的选择 尝试用三个一阶导数光谱区别较明显的三个谱段：9221.6-7965.9 cm 、7965.0-6173.3cm²和6173.0-4000.0cm，以及仪器推荐的光谱范围9881.5-4119.2 cm(选取导数光谱时均采用Norris平滑滤波进行校正)。表1为采用不同光谱范围和光谱预处理方法所建立的判别分析模型的误判样品数比较。 表1采用不同光谱范围和光谱预处理方法所建立的判别分析模型的误判样品数比较 Tablel Influence of NIR spectra range and pretreatment method on the number of misclassified samples 序号 No. 波数范围(cm) Wavenumber range (cm) Original NIR spectra First derivative spectra Second derivative spectra 校正集 验证集 校正集 验证集 校正集 验证集 1 9881.5-4119.2 2 0 0 0 0 0 2 9221.6-7965.9 18 3 0 0 1 1 3 7965.0-6173.3 7 1 0 0 0 2 4 6173.0-4000.0 4 0 0 0 0 0 从表1可见用一阶导数光谱在任何光谱范围的判错数均为0，用原始光谱的判错数最高，二阶导数光谱其次，说明采用一阶导数光谱可以非常好的消除基线的偏移，扣除本底，使各个不同厂家的特征区别更明显，从而达到良好的区分；另外，尽管在四个光谱范围一阶导数的判处率均为0%，但考虑到由于厂家较多，选取光谱范围越宽，利用的信息越充分，模型更稳健，最终选取波数范围为9881.5-4119.2 cm 。 3.2定性分析模型及样品判别结果 主成分分析(Principle Component Analysis， PCA) 是最常用的判别分析方法‘，它可以将多波长下的光谱数据压缩到有限的几个因子空间内，再通过样品在各因子空间的得分确定所属的类别。光谱数据经前述一节导数处理并选择光谱范围后，对其作PCA分析，以第一主成分对第二主成分作图，如图4。 图4样品在前两个主成分中的得分分布 Fig.4 Scatter plot of scores for the first and second PC of the 41samples from 9 different factories其中★香港澳美制药厂▲山东鲁抗医药股份有限公司●浙江金华康恩贝生物制药有限公司○海南三叶制药厂有限公司■甘肃兰药药业集团有限责任公司△昆明贝克诺顿制药有限公司口上海衡山药业有限公司丽珠集团丽珠制药厂十香港联邦制药厂有限公司 主因子数的选择是影响 PCA 法效果的一个关键因素。主因子数太少，会导致信息利用率过低，主因子数太多，则会引入许多无用或噪音信息，两者均会降低模型预测精度和稳健性。在本文的实验中，主成分数的选择对模型判错率的影响情况如表2。从中可见，当主因子数为15时，即可以对9个厂家的样品进行准确地判别分析，此时，光谱信息的利用率为99.93%。 表2主成分数对模型判错率及对累计贡献的影响 Table 2 The infection of principle components to misclassified and cumulative contribution 编号 主成分数 累计贡献% 判错数 1 10 99.74 3 2 14 99.91 1 3 15 99.93 0 4 16 99.94 0 5 20 99.96 0 4 定量分析 4.1数据处理方法 分别从32个实验室样品和41个工业样品中随机选取49个样品组成校正集，用于建立定量分析模型，其余24个样品当作未知样品组成预测集，用于验证模型的预测效果。光谱数据经多元散射校正 (Multiplicative Scatter Correction， MSC) 预处理和Norris导数平滑滤波后，采用偏最小二乘(Partial Least Square， PLS)回归法建立定量校正模型，以内部交叉验证均方差(RMSECV)为指标优化建模参数，以未知样品的预测均方差(RMSEP)及其相对偏差(RSEP)考察模型的预测准确性， RMSECV、RSECV、RMSEP和RSEP的计算公式见文献10]。 4.2定量分析模型的建立 4.2.1光谱预处理方法的选择 表3为分别采用原始光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱进行建模时的 RMSECV 值。从表3可见采用原始光谱时的 RMSECV 最小，这同建立定性分析模型时的光谱预处理方法 不同，因为样品的定性分析除了涉及样品组成信息外，还涉及到制剂工艺的不同带来的样品物理性质的差异，用一阶导数光谱消除各方面的影响选取特征信息来进行区分类别，而定量往往只需考虑组成浓度的不同，在本实验中则只需原始光谱即能达到最优化。 表3导数处理对校正模型 RMSECV 的影响* Table 3 RMSECV result of model using derivative spectra and original spectra No. 光谱预处理方法 主因子数 RMSECV 1 原始光谱 8 0.96 2 一阶导数 10 1.05 3 二阶导数 6 1.48 *光谱范围：10000-4000 cm 4.2.2光谱范围的选择 表4为使用不同谱区的光的：全谱带10000-4000 cm°、软件推荐光谱带8458.2-8331.0、8523.8-8489.1、8743.7-8651.1cm与自选光谱带9221.6-7965.9 cm、7965.0-6173.3 cm6173.3-4000.0cm°信息建立模型时的内部交叉验证均方差(RMSECV)值，其结果表明在10000-4000cm°范围内内部交叉验证均方差(RMSECV)最小，证明其最佳谱区为10000-4000 cm。 表4不同光谱范围的选择对参数的影响* Table 4 Eeffect of parameters on various wavenumbers of the spectra No. 光谱范围(cm) 主因子 数 RMSECV 10000-4000 8 0.96 2 8458.2-8331.0，8523.8-8489.1，8743.7-8651.1 7 1.43 3 9221.6-7965.9 9 1.29 4 7965.0-6173.3 8 1.45 5 6173.3-4000.0 9 2.37 光谱预处理方法： MSC+平滑+原始光谱 基于前述优化得到的光谱预处理方法、光谱范围及主因子数，即可建立定量分析模型。 4.3样品分析 用前面所建立的定量校正模型对验证集中24个样品浓度进行预测，预测值与真值的相关图见图4。从图中可见，24个未知样品的 NIR 预测值能够很好地逼近实际值，相关系数达到了 0.9983， RMSEP、RSEP分别为1.22%、0.96%。 表5为选取各个厂家的样品用 HPLC 测得的真实值与用模型预测值的比较。 图5校正集样品与预测样品真实值与预测值相关图 Fig.5 Scatter plots showing correlation between actual value and predicted value on the calibrated model 表5各个厂家的样品真实值与预测值的比较 Table 5Comparison between actual value and predicted value on the calibrated modle 编号 生产厂家 真实值 预测值 相对偏差% 1 香港澳美制药厂 74.19 75.68 2.01 2 昆明贝克诺顿制药有限公司 82.8 84.89 2.52 3 上海衡山药业有限公司 81.50 81.49 0.01 4 浙江金华康恩贝生物制药有限公司 82.05 82.82 0.94 5 香港联邦制药厂有限公司 80.02 79.88 0.17 6 山东鲁抗医药股份有限公司 83.74 83.87 0.16 7 甘肃兰药药业集团有限责任公司 81.22 81.69 0.58 8 丽珠集团丽珠制药厂 68.68 67.71 1.41 9 海南三叶制药厂有限公司 82.18 81.34 1.02 由表5可见，九个厂家的样品中相对偏差最大为2.52%，最小为0.01%，说明该模型可以对来自这九个厂家的样品的含量进行准确的测定。 4.4加样回收率 选取上海衡山药业有限公司提供的其中一批样品加入原料适量，按第2节方法采集各样品NIR光谱，利用前述的定量校正模型测试其浓度，计算加样回收率，结果见表4。加样回收率范围为97.66%~101.80%，平均回收率为 99.75%， RSD 为 1.4%。 表6.加样回收率结果 Table 6Result of recovery test 编号 样品浓度% 测得浓度% 回收率% 91.58 89.44 97.66 2 92.36 93.07 100.77 3 90.78 90.05 99.20 4 91.24 90.04 98.69 5 92.17 93.83 101.80 6 92.68 93.01 100.36 平均回收率 99.75 RSD(%) 1.4% 4.5 系统精密度与方法精密度 选取配制的14号样品，重复测试6次，测得系统精密度 RSD 为 0.3%； 选取配制的14号样品，装于不同的测试样品瓶测定6次，得方法精密度 RSD 为 0.6%。 5.结论 1.本文应用 NIR 漫反射光谱分析技术成功地对阿莫西林胶囊制剂进行了同时定性和定量分析，该方法准确可靠、方便快速，定量分析系统精密度、方法精密度以及加样回收率均良好，显示出良好的实用价值和应用前景。 2. NIR 光谱定量分析模型建建立对校正集样品化学组成的分布范围有一定要求，但实际上，工业上收集到的制剂样品化学组成范围往往都很小，为此，本文采用了工业样品和实验室配置样品相结合的方法，以扩大校正集样品化学组成的分布范围，取得了良好效果。 3. 值得注意的是，近红外光谱信息中不仅包含样品的化学组成信息，同时还与样品的物理性质有关。如果仅采用实验室配置的样品建立定量分析模型，我们发现所建立的模型难以适用于不同厂家的工业样品的预测分析。这是由于各厂家原辅料及制剂的工艺条件的不同带来了样品除了化学组成之外的一些物化性质的差异，这严重限制了实验室配置样品建立的分析模型的适用性。本文采用的实验室配置样品与工业样品相杂交的方法也同 时很好地解决了这一问题。 ( 参考文献： ) 1. 瞿海斌，刘全，程翼宇.近红外漫反射光谱法测定黄连浸膏粉中生物碱含量，分析化学，已录用。 ( 2. D.L. Wetzel. Anal. Chem.1983.55： 1 165A ) 3. Maurizio Ventura， Anton de Jager， Herman de Putter， Frans P.M.M. Roelofs. Non-destructivedetermination of soluble solids in apple fruit by near infrared spectroscopy (NIRS)， Postharvest Biologyand Technology， 1998，14：21-27 ( 4. Macho S.， L a rrechi M. S .， Near-infrared spectroscopy and multivariate calibration for th e qu a nti t ativedetermination of certain properties in the petrochemical industry， trends in analytical chemistry，2002，21(12)：799-806 ) ( 5. J. Amador-Herna'ndez， J.M. Ferna'ndez-Romero， M. D . Luque de Castro. 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