头孢拉定胶囊中近红外漫反射光谱法定量分析检测方案

近红外漫反射光谱法定量分析头孢拉定胶囊 潘颖1 沈漪1 项竞佐1 刘全2 1上海市药品检验所抗生素室， 上海200233 2 美国Thermo Nicolet仪器公司上海代表处，上海200031 摘要 目的：采用近红外（NIR）漫反射光谱法对不同生产厂家的头孢拉定胶囊进行快速定量分析。方法：按头孢拉定胶囊配方组成配制含主药头孢拉定浓度范围从5.01% ~ 91.24%的30个实验室样品，并收集来源于7个厂家的49批工业样品，采集其NIR光谱。采用偏最小二乘回归法建立NIR光谱信息与样品组成间的定量分析模型，将其用于对验证样品进行预测分析，并对该方法的加样回收率进行考察。结果：定量分析模型对21验证样品的的预测均方差RMSEP为1.35%，预测值与真值的相关系数R为0.9968，加样平均回收率为99.7%，RSD为0.7%（n=6）。结论：用近红外漫反射光谱法对头孢拉定胶囊进行定量分析的方法简便快速，结果准确可靠，可推广用于工业现场的实时在线检测。 关键词 近红外漫反射光谱法 头孢拉定胶囊 偏最小二乘回归 定量分析 Quantitative Analysis of Cefradine Capsule by Near-infrared Spectroscopy Pan Ying1, Shen Yi1, Xiang Jingzuo1, Liu Quan2 (1. Shanghai Institute for Drug Control, Shanghai 200233) (2. Thermo Nicolet Corporation Shanghai Representative Office, Shanghai 200031) Abstract Objective To determine the principal component in cefradine capsule by near-infrared(NIR) spectroscopy. Method 30 samples with a concentration range from 5.01% to 91.24% for cefradine were prepared in laboratory and 49 industry samples from 7 different factories were collected. Then their NIR spectra were collected on an Antaris FT-NIR analyzer. Partial least square regression (PLSR) algorithm was used to build the calibration model between the concentration of 59 calibration samples and their NIR spectra. At last, the model was validated by the other 20 validation samples. The recovery of the method has also been examined. Result The root mean square error of prediction (RMSEP) was 1.35%. The correlation coefficient between the true value and prediction value was 0.9968. The average recovery was 99.7% (RSD 0.67%, n=6). Conclusion The results show that the presented method is convenient, fast and has a good performance and can be applied to on-line detection in industrial process. Key words Near -Infrared Spectroscopy; Cefradine capsules; Partial least square regression (PLSR); Quantitative analysis 近红外（near-infrared，NIR）光谱技术是一种快速、无损分析方法，其光谱波长范围是780～2500nm（11000～4000cm-1），主要谱峰为有机物分子C-H、N-H和O-H等含氢基团的倍频与合频振动吸收所产生，光谱特性稳定，非常适合于药品原辅料及制剂的定性定量分析[1-5]。近几年来，得益于化学计量学、电子计算机及软件的发展，尤其是基于多变量数据分析的化学计量学的发展，使得NIR光谱中的大量信息能够被解释，这一技术因此而得到了广泛的应用。与传统的化学分析方法相比，NIR光谱技术具有分析迅速、操作简便等优点，它无需预处理即可测定多种状态的样品，如粉末、完整片剂及胶囊、完整的生物组织、浆液、混悬液等[6]。 头孢拉定为第一代头孢菌素，主要作用于革兰氏阳性菌包括耐青霉素金葡菌，临床主要治疗敏感细菌所致的呼吸道感染、生殖泌尿系统感染、软组织感染等[7]。头孢拉定胶囊临床应用广泛，目前国内也有很多厂家生产。各个生产厂家的产品质量参差不齐，更有不法之徒销售假药、劣药。现行的中国药典检测方法为高效液相色谱法，该方法需进行复杂的样品制备和预处理工作，分析时间较长，难以适用于工业现场的实时在线分析。 本文以某一厂家的头孢拉定胶囊处方组成配制了30个实验室样品，并收集了来源于7个厂家的50批工业样品，分别采集其NIR漫反射光谱。比较研究分别以主成分回归（Principle component regression，PCR）法和偏最小二乘回归（Partial least squares regression，PLSR）法建立定量分析模型，然后将此模型用于对验证样品含量进行预测，并考察该方法的加样回收率。结果证明，该方法结果准确可靠，可大大缩短定量检测的时间，达到快速分析的效果，可推广用于工业现场的实时在线分析。 1 实验 1.1 仪器与试药 Antaris傅立叶变换NIR光谱仪（美国Thermo Nicolet公司），配有积分球漫反射采样系统，Result操作软件，TQ Analyst 6.2光谱分析软件； 头孢拉定原料（纯度95.6%），辅料硬脂酸镁、滑石粉、乳糖为药用规格。 1.2 样品准备 实验室样品配制：按某一厂家头孢拉定胶囊处方组成配制含主药头孢拉定浓度范围从5.01% ~ 91.24%的30个实验室样品。 工业样品收集：头孢拉定胶囊样品共49批来源于7个厂家，它们分别是中美上海施贵宝制药有限公司16批、上海天平药厂3批、上海衡山药业有限公司3批、上海新亚药业有限公司15批、上海五洲药厂3批、上海美优制药厂2批及香港澳美制药厂7批。 1.3 NIR光谱测量 将胶囊粉末倒入同规格样品瓶中，利用积分球漫反射采样系统及Result操作软件测量其NIR光谱。光谱采集条件：以仪器内置背景为参比，波数范围10000～4000 cm-1，扫描次数40次，分辨率8 cm-1。图1为7个不同厂家的样品及一个实验室样品的原始NIR光谱图。 图1来源于7个不同厂家的样品的原始NIR漫反射光谱图 Fig. 1 Original NIR spectra of 7 samples from different factories 2 方法与结果 2.1 光谱预处理方法 NIR光谱采集过程中，由于样品颗粒大小、均匀性、仪器状态等因素的影响，往往会导致光谱基线产生偏移或漂移，因此建模前原始光谱需经过预处理。最常用的预处理方法为将原始光谱做导数处理[8]。原始光谱经导数处理，一方面可以消除基线偏移，另一方面可放大光谱信号，但是由于此时噪声信号也被放大，因此在对原始光谱求导之前，一般需对其进行平滑处理。图2为样品的原始NIR光谱经Norris derivative滤波和二阶导数处理后的光谱图，从图中可以看出，原始光谱经导数处理后，可消除基线偏移，扣除本底吸收，从而更能体现样品的光谱特征。 图2 来源于7个不同厂家的样品的二阶导数光谱 Fig. 1 Second derivative spectra of 7 samples from different factories 2.2 7个厂家样品NIR光谱的主成分分析 实验中所用到的7个厂家样品的原始光谱经前述预处理后，对其进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），其中前两个主成分反映了94.48%的信息。以第二主成分得分对第一主成分得分作图，如图3所示。总体看来，8个厂家的样品NIR信息在主成分空间上的分布具有比较明显的差异，基于此，我们可以建立定性判别模型，以对各厂家样品进行判别分析。由于本实验中样品数量较少，因此，没有进行这一工作，但是，基于NIR光谱的定性分析方法却具有良好的应用前景。 图3样品在前两个主成分中的得分分布构成的主成分空间中的分布 △－中美上海施贵宝制药有限公司；▲－香港澳美制药厂；＋－上海五洲药厂；●－上海新亚药业有限公司；□－上海衡山药业有限公司；○－上海天平药厂；■－上海美优制药厂 Fig.3 Plot of scores for the first and second PC of the 50 samples from 7 different factories 2.3 定量分析模型的建立 分别从30个实验室样品和50个工业样品中随机选取21个和39个样品组成校正集，用于建立定量分析模型，其余20个样品当作验证样品组成验证集，用于验证模型的预测效果。以校正集样品的交叉验证均方差(RMSECV)及其相对偏差（RSECV）为指标优化建模参数，以对验证集样品的预测均方差（RMSEP）及其相对偏差(RSEP)考察模型的预测准确性，RMSECV、RSECV、RMSEP和RSEP的计算方法分别如下式： 式中：是标准化学方法测得的值，是NIR预测值，是平均值，是校正集样品数，m为验证集样品数。本文中所有的数据处理均在TQ Analyst6.2软件中进行。 2.3.1 建模方法的比较 目前，NIR光谱定量分析中，最为常用的两种建模方法是PCR和PLSR。PCR法是先对光谱数据矩阵进行正交分解，提取主成分信息，然后在样品的浓度矩阵与主成分得分矩阵间建立回归模型。与PCR不同的是，PLSR在对光谱数据矩阵进行正交分解时，引入了样品浓度的信息，因此，它所提取出来的主成分信息与样品浓度间具有更好的相关性，因此PLSR较PCR建立的模型的性能一般会更好。本文以软件推荐使用的波数范围（6173.3～4068.9cm-1）和二阶导数光谱，分别以PLSR和PCR法建立了校正模型，结果如表1。 表1 PLSR和PCR法建立的校正模型的比较 Table 1 Comparison of the calibration model established by PLSR and PCR 建模方法 RMSECV RSECV RMSEP RSEP PLSR 2.85 3.72 1.32 1.74 PCR 4.69 6.13 4.05 5.35 由表1可以看出，用PLSR所建的模型得到的各个参数均优于用PCR所建的模型。因此本文选定以PLSR建立最终的定量分析模型。 2.3.2 光谱范围的选择 在确定了采用PLSR方法建立定量分析模型后，本文根据二阶导数光谱图不同谱区的光谱信息，选择了波数范围分别6173.3-4068.9cm-1、7541.6-4068.9 cm-1、9032.9-4068.9 cm-1的3个不同谱区，对比了这三个谱区与仪器推荐使用的谱区（4180.9- 4084.5，4377.6- 4223.3，4805.7- 4713.2），结果见表2。 表2光谱范围对分析模型的影响 Table 2 Influence of NIR spectra wavenumber ranges on calibration model 序号 光谱范围（cm-1） RMSECV RSECV RMSEP RSEP 1 6173.3-4068.9 2.85 3.72 1.32 1.74 2 7541.6-4068.9 2.85 3.72 1.52 2.01 3 9032.9-4068.9 2.73 3.57 1.51 1.99 4 4180.9- 4084.5,4377.6- 4223.3,4805.7- 4713.2 5.16 6.73 4.83 6.37 从表2可以看出，综合各项指标，本文拟选定6173.3 - 4068.9 cm-1波段为建模光谱范围。 2.4 验证样品的预测分析 用前面所建立的定量校正模型对验证集中20个样品进行预测，预测值与真值的相关图谱见图4。从图中可见，20个验证样品的NIR预测值能够很好地逼近实际值，相关系数R达到了0.9968，RMSEP、RSEP分别为1.35%、1.74%。 图5 校正集样品与验证样品真实值与预测值相关图 Fig.5 Scatter plots showing correlation between actual value and predicted value on the calibrated model 表3中列出了验证集中分别来源于7个厂家的12个样品主药含量的NIR预测值与真值及其偏差。从中可以看出，各个厂家的真实值与预测值都比较接近，其相对偏差最大的为1.93%，最小的为0.20%，均小于定量分析允许的误差。由此可见，所建的模型能够准确地测定这7个厂家的样品。 表3 7个厂家12个头孢拉定胶囊样品中主药含量真实值与预测值的比较 Table 3 Comparison between actual value and predicted value on the calibrated model 样品来源 真实值 预测值 相对偏差（%） 样品来源 真实值 预测值 相对偏差（%） 上海新亚药业有限公司 84.18 86.27 0.64 中美上海施贵宝制药有限公司 82.70 82.36 0.20 86.04 84.95 0.64 81.60 82.45 0.52 84.11 86.19 1.22 83.70 82.14 0.94 香港澳美制药厂 70.75 73.53 1.93 上海衡山药业 89.78 89.40 0.21 70.15 71.04 0.62 上海五洲药厂 78.99 78.52 0.30 上海天平药厂 83.12 82.13 0.60 上海美优制药厂 83.68 81.13 1.55 2.5 加样回收率测定 任意选取中美上海施贵宝制药有限公司提供的一批样品，加入头孢拉定原料适量，混合均匀后采集其近红外光谱。用前述的模型对其含量进行预测分析，以测试加样回收率，所得的结果如表4。加样回收率范围为98.58% ~ 100.34%，平均回收率为99.7%，RSD为0.7%。 表4 加样回收率实验结果 Table 4 Result of recovery test 编号 样品浓度（%） 测得浓度（％） 回收率（％） 1 89.56 89.58 100.02 2 89.59 89.57 99.98 3 89.69 88.42 98.58 4 89.58 89.88 100.34 5 89.64 89.75 100.12 6 89.50 88.59 98.98 平均 99.7 RSD（n=6） 0.7 3 结论 本文建立了快速测定头孢拉定胶囊中主药含量的NIR漫反射光谱分析方法，结果表明，该方法准确可靠，加样回收率也良好。 NIR光谱分析是一种二次分析方法，它的适用性和推广能力与校正集中样品的代表性具有很大关系。因此，定量分析模型的建立对校正集样品化学组成的分布范围有一定要求，但实际上，工业上收集到的制剂样品化学组成范围往往都很小，为此，本文采用了工业样品和实验室配置样品相结合的方法，以扩大校正集样品化学组成的分布范围，取得了良好效果。 在本文的实验中还发现，NIR光谱分析技术除了可用于对样品进行快速、无损地定量分析外，它在定性分析方面也具有良好的应用前景。 参考文献 [1] John D.Kirsch，James K. 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