高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素

本文采用岛津LC-16高效液相色谱仪，参考《GB 5009.284-2021食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》，对婴幼儿配方奶粉中4种香兰素进行测定。本方法检测灵敏度高、重复性好，系统精密度良好，可为食品安全检测行业检测工作提供参考。SSL-CA23-166Excellence in Science Excellence in ScienceLC-379 高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的香 兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素 LC-379 摘要：本文建立了一种岛津液相色谱仪测定食品中香兰素、、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的方法。参照 《GB 5009.284-2021食品安全国家标准食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》，对样本 进行前处理并上机测定。结果表明：香兰素、甲基香兰素、乙基香 兰 素和香豆素在 0.2~100 mg/L浓度范围内 线性关系良好，相关系数在0.999 以上；0.2 mg/L的标准溶液连续6针进样，保留时间和峰面积的相对标准 偏差分别在 0.015~0.024%和0.18~0.54%之间；不同加标浓度下，婴幼儿配方奶粉中四种 化 合物的加标回 收率结果在73.7~106.4%之间。 关键词：高效液相色谱仪 香兰素 甲基香兰素 乙基香兰素 香豆素 技术特点： 必仪器灵敏 度 高，香兰素、甲基香 兰 素、乙基香兰素和香豆素在 LC-16 上仪器定量限可低至 0.03mg/L。心使用岛津 Shim-pack GIST C18-AQ 色谱柱，甲基香兰 素 和乙基香兰 素 可以获得良好的分离度。 2760-2014食 品 添加剂使用标准》中关于添加量的规 定：较大婴儿和幼儿配方食品中 可 以使用香兰素、乙 基香兰素和香荚兰豆 浸 膏(提取物)，最大使用量分 别为 5 mg/100 mL 和 5 mg/100 mL， 其中 100mL 以即食食品计，生产企业应按照冲调比例折算成配方 食品中的使用量。 本文参照《GB 5009.284-2021食品安全国家标 准食品中香兰素、甲基香兰素 、乙基香兰素和香豆素 的 测定》，以婴幼儿配方奶粉为基质，对香兰素、甲 基香兰素、乙基香兰素和香豆素进行测定。 色谱工作站： Labsolutions Essentia Ver . 5.98 1.2分析条件 色谱柱：：Shim-pack GIST C18-AQ (250 mm × 4.6 mm l.D.， 5um， 岛津(上海)实 验 器材有限公司， P/N： 227-30737-01) 流动相 ： A相-0.5%甲酸溶液，B相-乙腈 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始比例为45%，，梯度洗脱程序见表1 柱 ： 30°℃ 温流 量波 速 束：：1.0mL/min 进样 量： 10pL 长： 279 nm 表1 梯度洗脱程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 5.0 泵 B.Conc 60 5.1 泵 B.Conc 90 8.0 泵 B.Conc 90 9.1 泵 B.Conc 45 14.0 控制器 Stop 1.3混合标准溶液的制备 试药与试剂 香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素混标(1000 mg/L， 纯 度 ≥98%)；甲酸(HPLC级)；乙 腈 (HPLC 级))；甲 醇 (HPLC级)；氯化钠(优级纯)；浓盐酸(12mol/L) ； Mil l i -Q纯水。 试剂配制 0.1%甲酸-甲醇溶液：吸取1mL甲酸溶于甲醇，定容至1000ml， 临用现配。 1 mol/L 盐酸溶液：吸取 8.33mL 浓盐酸溶于水，定容至100 mL， 临用现配。 80%甲醇-水溶液：将甲醇和水按4：1(体积比)混合均匀。 0.5%甲酸溶液：吸取5mL甲酸溶于水，定容 至 1000mL， 临用现配。混合标准溶液的配制 混合标准中间溶液(10mg/L)：准确吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素混合标准储备液(1000mg/L) 1 mL 置 于 100mL容 量 瓶 中 ，加0.1%甲酸 -甲醇定容至刻 度 ，混匀。将溶液转移 至 棕色玻璃容器中，-18℃下避光保存，可保存3个月。 混合标准系列工作溶液：分别吸取混合标准中间溶液(10 mg/L) 0.2 mL、1.0 mL、5.0mL， 混合标准储备 液(1000 mg/L) 0.2 mL、0.5 mL和 1.0 mL， 分别置于10 mL容 量 瓶 中 ，加80%甲醇-水溶液定容至刻度，混匀。混合标准系列工作溶液的浓度分别为 0.2 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L，临 用现配。 样品前处理 称取1.00g试样，加入10mL水和480 uL的1mol/L盐酸溶液，涡旋振荡1 min， 加入20mL乙腈，涡旋 振荡 1 min， 超声提取 30 min 后，加入5g氯化钠，涡 旋振荡2 min， 8000 r/min 离心5 min， 取上清液至玻 璃试管，40℃氮吹至近干，准确加入1.0mL 的80%甲醇-水溶液溶解残渣，过 0.45 um 微孔滤膜后，待 测 。 ■结果与讨 论 3.1色谱图 图1 0.2 mg/L 香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素标准 溶 液色谱图 表2化 合 物保留时 间、峰面积及分离度结果 香兰素 甲基香兰素 乙基香兰素 香豆素 保留时间 4.918 6.437 6.713 7.567 峰面积 7163 6180 6649 6989 分离度 一 7.554 1.340 4.235 3.2校准 曲 线、检出限和定量限 将混合标准系列工作溶液，按“1.2分析条件”进行测定，使用外标法定量。以峰面积为纵坐标，对应 的混合标准工作溶液浓度为横坐标，绘 制 校准曲线，如图2所示。校准曲线线性关系良好，相关系数均大于 0.999，准确度在94.7%~109.4%之间。LabSolutions 软件依据信噪比自动计算检出限(S/N=3)及定量限(S/N=10)。相关系数、检出限及定量限结果见表3。 乙基 香 兰 素 香豆素 图 2校准曲线 表33校准曲线、检出限 和 定 量 限结果 NO. 化合物 校准曲线 相关系数r 线性范围 (mg/L) 准确度% 检出限 (mg/L) 定量限 (mg/L) 1 香兰素 Y=39065.0X-1354.65 0.9998 0.2-100 94.7-109.0 0.01 0.02 2 甲基香兰素 Y=35316.2X-1520.75 0.9998 0.2-100 94.7-109.0 0.01 0.03 3 乙基香兰素 Y=38664.5X-1749.35 0.9998 0.2-100 95.0-108.6 0.01 0.03 4 香豆素 Y=41811.3X-2098.93 0.9998 0.2-100 95.2-108.7 0.01 0.03 3.3重复性试验 取浓度为 0.2 mg/L 的混合标准工作溶液连续测定6次，考察仪器的 重复 性，保留 时 间和 峰 面积的重 复 性结 果如表4所示。结果显示：各化合物保留时 间 和峰面积的相对标准偏差分别在 0.015~0.024%和0.20~0.41%之间，表明仪器精密度良好。 图30.2 mg/L 香兰素、甲基香兰素、乙 基香兰素和香 豆 素 重 复性色谱图 表4 峰面积和保留时间重复性结果(n=6) 香兰素 甲基香兰素 乙基香兰素 香豆素 # 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 1 7158 4.914 6101 6.429 6607 6.706 6916 7.558 2 7122 4.911 6107 6.428 6628 6.705 6944 7.558 3 7117 4.912 6120 6.428 6570 6.705 6973 7.557 4 7134 4.911 6101 6.428 6597 6.704 6955 7.556 5 7137 4.911 6068 6.426 6552 6.703 6945 7.556 6 7132 4.910 6125 6.426 6581 6.702 6931 7.555 RSD (%) 0.20 0.024 0.33 0.021 0.41 0.020 0.28 0.015 3.4加标回收率 在空白婴幼儿配方奶粉样品中添加3个不同浓度混合标准溶液，加标浓度分别为 0.2 mg/kg， 5 mg/kg， 50mg/kg， 每个浓度平行三份，按照“2.样品前处 理 ”方法处理后，上机分析，考察加标回收率。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素在婴幼儿配方奶粉中的加标回收率结果在73.7~106.4%之间，结果见表5。 图 4 婴幼儿配方奶粉 空 白样品(蓝色曲线)及加标 0.2 mg /kg 样品(黑色曲线)色谱图 表5婴幼 儿 配方奶粉样品加标回收率结果 (n =3) 加标量 (mg/kg) 香兰素 甲基香兰素 乙基香兰素 香豆素 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 0.2 106.4 2.07 105.2 4.09 100.4 7.87 106.4 2.07 5 80.2 5.18 81.5 5.57 80.6 5.43 79.1 4.57 50 74.2 1.11 74.8 1.15 74.6 1.17 73.7 0.81 结论 本文采用岛津 LC -16 高效液相色谱仪，参考《GB 5009.284-2021 食品安全国家标准食品中香兰 素、甲基香 兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》，对婴幼儿配方奶粉中4种香兰素进行测定。本方法检测灵敏度高、重 复性好，系统精密度良好，可为食品安全检 测 行 业检 测工作提供参考。 岛津应用云