乳粉中兽药残留检测方案

乳制品中农残、兽残检测 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定牛奶中的6种β-内酰胺类抗生素残留 摘商要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定牛奶中6种常见β-内酰胺类抗生素残留的检测方法。该方法在2.5 min内完成青霉素 G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素六种常见β-内酰胺类抗生素的分离。在牛奶基质中青霉素 G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素在 0.2~500 ng/mL 范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在0.996以上。用牛奶基质配制浓度为 5 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL 的标准溶液考察重复性，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.03~0.12%和2.43~4.96%之间，仪器精密度良好。牛奶中6种常见β-内酰胺类抗生素的定量限在 0.038~0.085 ng/mL 之间，检出限在 0.011~0.025 ng/mL 之间。 关键词： 三重四极杆质谱牛奶 β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺类抗生素(β-lactams)是指化学结构中具有β-内酰胺环的一类抗生素，包括临床常用的青霉素与头孢菌素。其化学结构特点，特别是侧链的改变形成了许多不同抗菌谱和抗菌作用的抗生素。此类药物广泛用于产肉动物的呼吸、肠胃、泌尿生殖和皮肤病毒感染的治疗和预防，它们的使用会引起动物源性食品中兽药残留的存在，这种残留将对青霉素过敏的人产生健康危害。更为重要的是，抗生素被长期低剂量摄入健康人肠道，会破坏健康人肠道正常菌群环境，导致人体免疫力的降低使用后会在动物体内有一定的残留，食用含有β-内酰胺类抗生素残留的食品后会危害人们身体健康，已有人食用牛奶后引起青霉素过敏，而且长期使用会产生抗药性。为确保消费者的食品安全，世界各地均对牛奶中上述各种青霉素有允许最大残留量的要求。本研究参照《SN/T2050-2008 进出口动物源食品中14种β-内酰胺类抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱 LCMS-8040 联用建立牛奶中的6种常见β-内酰胺类抗生素残留的检测方法。 1.实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8040 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LCMS-8040三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.50色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shimadzu Shim-pack XR-ODS ⅢI (2.0 mm I.D.×50 mm L.， 1.6 um) 流动相：A：0.1%甲酸水溶液； B：乙腈 流速： 0.4mL/min 柱温：：40℃ 进样量：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.80 Pumps Pump B Conc. 65 2.00 Pumps Pump B Conc. 90 2.50 Pumps Pump B Conc. 90 2.51 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8040 离子源： ESI，.9正离子 加热模块温度： 500℃ 脱溶剂管温度： 300℃ 雾化气流速： 3.0 L/min 加热气流速： 15.0L/min 离子源电压： 4.5kV 扫描模式： 多反应监测(MRM) MRM 参数： 见表2 1.3标准工作溶液的配制 标准物质：共6种，青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素、邻氯青霉素、青霉素。 标准工作溶液配酒：用乙用-水(1：1)配制1 mg/mL的标准贮备液，用乙腈-水(2：8)溶液稀释成 5 ug/mL 的混合标准溶液。 表2 样品 MRM 参数及信息 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 英文名 CAS 青霉素G 335.1 160.00 -23.0 -10.0 -15.0 peillin G 61-33-6 176.20 -23.0 -11.0 -11.0 青霉素V 351.20 160.10 -26.0 -11.0 -28.0 Penicillin V 87-08-1 114.10 -25.0 -29.0 -11.0 苯唑青霉素 402.20 160.10 -29.0 -15.0 -30.0 Proctaphlin 1173-88-2 243.10 -29.0 -14.0 -25.0 乙氧萘青霉素 414.90 199.10 -20.0 -14.0 -20.0 Nafcillin 7177-50-6 255.90 -20.0 -16.0 -27.0 邻氯青霉素 436.10 277.10 -23.0 -15.0 -30.0 Cloxacillin 7081-44-9 160.10 -16.0 -15.0 -30.0 双氯青霉素 470.00 160.00 -24.0 -15.0 -16.0 Dicloxacillin 343-55-5 310.90 -24.0 -13.0 -21.0 *表示定量离子 1.4标准曲线的配制 牛奶前处理液用氮气吹干后再用乙腈-水(2：8)溶液复溶，该复溶液过 0.22 um有机滤膜后再用其将5 ug/mL的标准溶液稀释成 500ng/mL、200 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5ng/mL、1 ng/mL、0.2 ng/mL 系列浓度的混合标准工作液。 前处理方法采用《SN/T2050-2008进出口动物源食品中14种β-内酰胺类抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》的第7部分。 2.结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 图1青霉素G一级质谱图 图2青霉素G产物离子扫描图(CE值-15V) 图3青霉素V一级质谱图 图5苯唑青霉素一级质谱图 图7乙氧萘青霉素一级质谱图 图9邻氯青霉素 -级质谱图 图11双氯青霉素一级质谱图 2.2牛奶基质加标样品的 MRM色谱图 图4青霉素V产物离子扫描图(CE值-10V) 图6苯唑青霉素产物离子扫描图(CE值-15Ⅴ) 图8乙氧萘青霉素产物离子扫描图(CE值-15V) 图10邻氯青霉素产物离子扫描图(CE值-15V) 图12双氯青霉素产物离子扫描图(CE值-15V) 空白牛奶样品的色谱图如图13所示，加标样品色谱图如图14所示。 图13牛奶空白基质样品的 MRM 色谱图 图14基质加标样品的 MRM 色谱图 (1 ng/mL) 2.3线性关系 将0.2 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL 系列浓度的标准溶液按1.2中的分析条件进行分析，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图15至图20所示。青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉在 0.2~500 ng/mL 范围内校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3. 图15青霉素G标准曲线 图16青霉素V标准曲线 Area(x1，000，000) 图17苯唑青霉素标准曲线 图18乙氧萘青霉素标准曲线 图19邻氯青霉素标准曲线 图20双氯青霉素标准曲线 表3 六种β-内酰胺类抗生素的校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 线性范围 相关系数r (ng/mL) 1 青霉素G Y=(1929.66)X+(-100.168) 0.2~500 0.9979 2 青霉素V Y=(3084.31)X+(227.681) 0.2~500 0.9999 3 苯唑青霉素 Y=(2606.83)X+(-112.456) 0.2~500 0.9978 4 乙氧萘青霉素 Y=(10875.9)X+(229.853) 0.2~500 0.9997 5 邻氯青霉素 Y=(1715.38)X+(22.3400) 0.2~500 0.9962 6 双氯青霉素 Y=(1551.58)X+(68.1587) 0.2~500 0.9990 2.4精密度实验 对 5 ng/mL、50 ng/mL 和 200 ng/mL 混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。3个浓度标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.03~0.12%和2.43~4.96%之间，仪器精密度良好。 2.5灵敏度分析 用牛奶基质按照1.4进行处理后稀释混标得到浓度为 0.2 ng/mL 的溶液进样分析，六种β-内酰胺类抗生素的最低检出限(S/N=3， LOD 表示)、最低定量限(S/N=10， LOQ表示)结果如表5所示。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 样品名称 RSD% (5ng/mL) RSD%(50 ng/mL) RSD%(200 ng/mL) R.T Area R.T Area R.T Area 青霉素G 0.10 4.96 0.12 2.43 0.07 2.85 青霉素Ⅴ 0.08 4.65 0.10 3.76 0.08 4.91 苯唑青霉素 0.09 4.67 0.09 4.64 0.06 3.99 乙氧萘青霉素 0.07 2.47 0.06 2.66 0.08 2.98 邻氯青霉素 0.08 4.02 0.08 3.33 0.06 2.26 双氯青霉素 0.08 4.76 0.06 3.17 0.03 3.55 表5六种β-内酰胺类抗生素的检出限和定量限 No. 名称 信噪比 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 1 青霉素G 23.62 0.025 0.085 2 青霉素V 30.21 0.020 0.066 3 苯唑青霉素 29.25 0.021 0.068 4 乙氧萘青霉素 53.19 0.011 0.038 5 邻氯青霉素 36.70 0.017 0.055 6 双氯青霉素 32.94 0.018 0.061 2.6基质加标实验 用牛奶基质按照1.4进行处理后加混标至1 ug/kg， 平行3份样品测定回收率。具体结果如表6，样品加标回收率在 96.84~105.60%之间。 表6加标样的回收率结果(n=3) No. 样品名称 实测平均值(ug/kg) 回收率(%) 1 青霉素G 1.0560 105.60 2 青霉素V 1.0250 102.50 3 苯唑青霉素 0.9684 96.84 4 乙氧萘青霉素 1.0032 100.32 5 邻氯青霉素 1.0362 103.62 6 双氯青霉素 1.0500 105.00 3.结论 本应用建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A串联三重四极杆质谱仪 LCMS-8040测定牛奶中六种β-内酰胺类抗生素的方法。该方法在2.5 min内完成青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素、邻氯青霉素、双氯青青六种β-内酰胺类抗生素的分离，线性范围均为0.2~500 ng/mL， 相关系数均在0.996以上。用处理过的牛奶基质配制5 ng/mL